Экспериментальная Заражение<em> листерий</em> В качестве модели для изучения хоста интерферон гамма ответов
Summary
Этот протокол описывает , как прививают C57BL / 6J мышей штамма EGD из листерий (L. моноцитогенес) и для измерения интерферона-гамма (IFN-gamma) ответов на естественных киллеров (NK) клеток, естественных киллеров Т (НКТ) клеток, и адаптивным Т-лимфоциты после заражения. Этот протокол также описывает , как проводить исследования выживаемости у мышей после заражения с помощью модифицированного LD 50 дозы возбудителя.
Abstract
L. моноцитогенес является грамположительной бактерией , которая является причиной болезней пищевого происхождения в организме человека. Экспериментальная инфекция у мышей с этим патогеном является высокоинформативным о роли врожденной и адаптивной иммунных клеток и специфических цитокинов в хозяина иммунитета против внутриклеточных патогенов. Получение IFN-gamma врожденными клетками во время сублетального инфекции с L. моноцитогенес имеет важное значение для активации макрофагов и ранний контроль возбудителя 1-3. Кроме того, производство IFN-γ с помощью адаптивных лимфоцитов памяти имеет важное значение для заливки активации врожденного клеток на реинфекцией 4. L. моноцитогенес модель инфекции , таким образом , служит отличным инструментом для исследования , могут ли новые методы лечения, которые предназначены для увеличения производства IFN-gamma оказывают влияние на IFN-γ ответы в естественных условиях и имеют продуктивные биологические эффекты , такие как увеличение бактерий зазор или улучшение выживания мыши изинфекционное заболевание. Описанная здесь является базовым протоколом для того, как проводить внутрибрюшинные инфекции C57BL / 6J с штамма EGD от L. моноцитогенес и измерить продукцию IFN-gamma NK клетками, клетками NKT и адаптивное лимфоцитов при помощи проточной цитометрии. Кроме того, процедуры описаны в: (1) расти и готовить бактерии для инокуляции (2) измерения бактериальной нагрузки в селезенке и печени, а также (3) выживание мера животного к конечным точкам. Также предоставляются представительные данные для иллюстрации того, как эта модель инфекция может быть использована для проверки влияния специфических агентов на IFN-gamma ответов на L. моноцитогенес и выживаемости мышей от этой инфекции.
Introduction
ИФН-γ представляет собой цитокин , который имеет решающее значение для опосредования иммунитета против внутриклеточных патогенов и для контроля роста опухоли 5. Важность этого цитокина в бактериальной резистентности проявляется в наблюдении , что люди с мутациями в сигнальном пути IFN-гамма очень восприимчивы к инфекции с микобактериями и сальмонелл 6. Кроме того , у мышей с дефицитом либо IFN-gamma или IFN-γ дефектов рецептора выставляться в устойчивости к микобактерий 7-9 и других внутриклеточных патогенов , включая L. моноцитогенес 10,11, Лейшмания основная 12, Salmonella Typhimurium 13, и некоторые вирусы 11. В дополнение к борьбе с патогенами, IFN-γ играет решающую роль в принимающей обороны против опухолей 14. Хотя выше производство IFN-gamma является полезным в контексте инфекции или рака, длительное производство этого цитокина было связано тО развитии системного аутоиммунитете 15-17 и ускорения развития диабета типа I в не страдающих ожирением диабетической модели мыши 18.
Основными источниками IFN-gamma включают NK – клетки, клетки NKT, γδ Т – лимфоциты, хелперные 1 (Th1) клеток Т и цитотоксических Т – лимфоцитов (CTL) 5,19,20. IFN-γ повышает как врожденный и адаптивный иммунитет путем: (1) до регулирующего главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и выражение II, (2) увеличение экспрессии костимуляторных молекул на антиген-представляющих клеток, (3) повышение макрофагальной фагоцитоз и производство провоспалительных цитокинов и антимикробные факторы (например, оксид азота и активные формы кислорода), (4) содействие дифференцировки наивных CD4 + Т – клеток в эффекторные клетки Th1, (5) содействие переключения класса антител к иммуноглобулина ( Ig), 2a и IgG3 (у мышей), (6) индукции продуцирования хемокинов привлекать клетки иммунной системы к участкам Infection, и (7) повышение NK клеток и CTL ответов 5,19. Учитывая исключительную важность IFN-gamma в ответ хозяина к патогенам и опухолей, рекомбинантный IFN-γ была испытана в качестве лечения различных инфекций и злокачественных опухолей (обзор в 19). Тем не менее, так как системное введение IFN-gamma или Th1 способствующего цитокина интерлейкина-12 (IL-12) связано с побочными эффектами и от дозы токсичность 19,21, существует заинтересованность в разработке альтернативных стратегий для повышения IFN-γ производства путем иммунные клетки. Разработка новых биопрепаратов и малых молекул требуется в естественных условиях скрининговых инструментов для тестирования повышают ли такие средства производства IFN-gamma в ходе иммунного ответа и переводит ли это в значимые биологические эффекты , такие как повышение выживаемости животных.
Экспериментальная инфекция у мышей с грамположительной бактерии L. моноцитогенес была инструментальная модельрасшифровке роль IFN-gamma в хост-иммунитета против внутриклеточных патогенов 1,22. Заражение мышей с патогеном внутривенно или внутрибрюшинно (IP) приводит к быстрому распространению бактерий в селезенке и печени, где они становятся интернализованной резидентами макрофагов и гепатоцитов с пиковыми нагрузками бактерий в селезенке, происходящих от 3 до 4 дней пост- инфекция 1,3,22. Получение IFN-gamma NK клетками является важным для активации макрофагов и ранней устойчивости к возбудителю 3; Однако при высоких дозах инфекционных, производство IFN-gamma также может быть вредным для патогена зазор 23. НКТ – клетки также являются источником IFN-gamma в селезенке и печени во время раннего контроля патогенов 2,24 и это производство было показано, усиливает продукцию IFN-gamma другими типами клеток , включая клетки NK 2. С другой стороны, в дальнейшем действующие адаптивные Т – лимфоциты, CD8 + Т – клеток в Partiлярных, имеют важное значение для опосредования зазор возбудителя и обеспечивая защиту от повторного заражения 1,4,22.
Эта модель инфекции была привлекательной для исследователей по целому ряду причин (обзор 1). Во-первых, заражение патогеном является высокой воспроизводимостью и индуцирует сильную Th1 и клеточный иммунный ответ. Во-вторых, во время сублетального инфекции, бактериальной нагрузки концентрируется в печени и селезенке, где он может быть легко измерены. В-третьих, возбудитель может быть безопасно работать в соответствии с биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) условиях. В-четвертых, организм и иммунный ответ, который он создает, были широко охарактеризованы. И, наконец, различные мутантные и генетически модифицированных штаммов были разработаны, которые доступны для использования.
Описанное здесь является основным протоколом для прививки C57BL / 6J с штамма EGD Л. моноцитогенес 25 и для измерения IFN – γ повторноН.К. ответах, НКТ и адаптивных лимфоцитов после инфицирования. Также описано , как измерять бактериальной нагрузки в селезенке и печени после сублетального инфекции и провести исследования выживаемости после инфицирования с модифицированной LD 50 дозы возбудителя. И, наконец, репрезентативные данные показаны как этот протокол может быть использован для скрининга влияния новых обработок на ответах IFN- и выживаемости мышей от L. моноцитогенес инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол о том , как проводить основную экспериментальную инфекцию штамма EGD из L. моноцитогенес 25 самок и самцов C57BL / 6J. Этот протокол был создан с целью изучения влияния нового малую молекулу IS001 на производство IFN-gamma врожденным и адаптивным лимфоцитов в ест…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
