מדידה<em> במבחנה</em> פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
חלבוני מעטפת HIV-1 לעסוק קולטנים מאותו מקור על פני תא היעד, מה שמוביל היתוך קרום ויראלי תאים ואחריו שחרורו של קפסיד ויראלי (CA) הליבה לתוך הציטופלסמה. בהמשך לכך, transcriptase ההפוכה ויראלי (RT), כחלק ממכלול nucleoprotein שם כינתה את השעתוק לאחור המורכב (RTC), ממיר את גנום RNA חד-גדילי ויראלי לתעתיק פעמי גדילי דנ"א (vDNA). זה מוביל biogenesis של אחר מורכבי nucleoprotein, כינה את המורכבות ואינטגרציה-מראש (PIC), מורכבת vDNA וחלבוני הווירוס קשור וגרם מארח. Integrase ויראלי הקשורים PIC (IN) מנצח על אינטגרציה של vDNA לתוך דנ"א כרומוזומלי המארח תהליך בן שני שלבים מוסדר temporally מרחבית. ראשית, בתהליכים הקצוות "3 של vDNA בציטופלסמה, ושנית, לאחר PIC traffics לגרעין, שהוא מתווך אינטגרציה של vDNA מעובד לתוך ה- DNA כרומוזומלי. התמונות מבודדותמתאי היעד נגועים בחריפות עם HIV-1 הם פונקציונליים במבחנה, כפי שהם המוסמכות לשלב את vDNA הקשורים לתוך ה- DNA היעד אקסוגני הוסיף Heterologous. PIC מבוסס כאלה מבחני אינטגרציה במבחנה תרם תרומה משמעותית לתחום את הפרטים מכניסטית של אינטגרצית retroviral וכדי לגלות לפי מעכבים. בדו"ח זה, אנו לפרט על ב assay עודכן HIV-1 PIC המעסיקה תגובת שרשרת פולימראז כמותיים מקוננת בזמן אמת (qPCR) אסטרטגיה מבוססת למדידת פעילות האינטגרציה חוץ גופייה של תמונות יליד מבודדות.
Introduction
HIV-1 שכפול בתא היעד כרוך שלבים מרובים, מקובצים באופן כללי לשתי שלבים: אירועים מוקדמים ומאוחרים. האירועים מוקדם להתחיל כאשר ברצף HIV-1 נקשר לקולטן תא המטרה CD4 ואחד משני הקולטנים-שיתוף (CCR5 או CXCR4) 1. כתוצאה מכך, את פתיל ממברנות תאי וירוס, ואת קפסיד ויראלי (CA) ליבה הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה 2. ליבת CA מכיל את רנ"א חד-גדילי גנומית ויראלי (ssRNA) וכמה חלבונים, הן ויראליות הסלולר במקורם. החלבונים ויראלי קשורים CA כוללים transcriptase ההפוכה (RT) ואת אינטגראז (IN), שני אנזימים אשר מתווכים שלבים קריטיים במהלך אירועים מוקדם בשכפול נגיף. קל RT ו בתפקוד בהקשר של מתחמי nucleoprotein, כלומר מורכבים שעתוק לאחור (RTC) ואת מורכבות מראש אינטגרציה (PIC), בהתאמה 3, 4, 5 <sup>, 6. הקצות חוזרות מסוף נמל הגנום הנגיפי ssRNA (R) אלמנטים סמוכים אל U5 הרצפים הייחודי (ב 5 'בסוף) ו- U3 (על 3' בסוף). RTC ממיר את הגנום ssRNA ויראלי לתעתיק פעמיים גדילי דנ"א (DS) (vDNA). תהליך השעתוק לאחור זה גם גרם שכפול של רצפי U5 ו- U3, ובכך לייצר חוזר מהסוף ארוך (LTR) בשני הקצוות של vDNA 7, 8. כתוצאה מכך, לפי קשור PIC מזרז שתי תגובות ביוכימיות רציפות המאפשרות את האינטגרציה של vDNA לתוך כרומוזום מארח 9, 10, 11. ראשית, בציטופלסמה, לפי multimers לעסוק הן Ltrs 12 וידבק dinucleotide מכל הקצוות 3'-סופנית. עיבוד 3'-סוף זה מפיק קבוצת הידרוקסיל בכל 3'-end (CA OH) של vDNA.לאחר מכן, PIC traffics לגרעין, שבו לפי משתמשת CA vDNA OH בתור נוקלאופיל לחתוך שני הגדילים של ה- DNA כרומוזומלי בצורה מדורגת. במקביל, מתואם שזור בשני הקצוות של vDNA אל קשר פוספודיאסטרי וכתוצאה מכך על גדילים השניים של דנ"א כרומוזומלי. בעקבות צעד העברת גדיל זה, מנגנון תא המארח מסיר את שני נוקלאוטידים מזווגים בקץ '5 של vDNA ומתקן את הפערים חד גדילים שהתפתחו בצומת של אתר האינטגרציה. האירועים מוקדם ובכך לשיאה עם הקמת עותק דנ"א משולב (provirus) של הגנום HIV-1. Provirus מספק סביבה מתאימה עבור ביטוי גנים ויראלי יעיל, אשר יוזם אירועים מאוחרים יותר, כולל את הביטוי של חלבונים המקודדים וירוס; הרכבה של וירוס לא בשלה; ניצנים, שחרור, והתבגרות לתוך virions זיהומיות 13.
לפי retroviral רקומביננטי מזוכך מוסמךלבצע, במבחנה, פעילויות 3'-end עיבוד גדיל העברה הן מסופקות אקסוגני DNA מצע LTR דמוי. מחקרים ביוכימיים באמצעות IN רקומביננטי מזוכך כגון חשפו היבטים קריטיים של אינטגרציה vDNA 14, 15, 16, 17. עם זאת, שלא כמו זיהום טבעי, תגובה ביוכימית במבחנה זה אינו תומך אינטגרציה מתואמת של שני הקצוות של DNA המצע לתוך ה- DNA היעד. לעומת זאת, התמונות retroviral מבודד תאים נגועים בחריפות המטפלים יחדיו לשלב את שני הקצוות של vDNA אנדוגני לתוך ה- DNA היעד Heterologous. זה הוביל את האימוץ הנרחב והחידודים הבאים של לי n אינטגרצית Vitro (IVI) מבחנים באמצעות תמונות יליד מבודדות.
בחודש הראשון דיווח assay IVI retroviral, תמציות ציטופלסמית מתאים נגועים Murine רקומביננטיוירוס לוקמיה (MLV) מחסה הגן coli supF א ב LTR שלה ששימשו כמקור הפעילות, ואת ה- DNA של הפאג למבדה מוטציה פגום בצמיחה ממס סופק אקסוגני כמו ה- DNA היעד. השתלבות מוצלחת של ה- DNA MLV רקומביננטי להעתיק לתוך ה- DNA הפאג והביטוי supF שהתפתח הוביל לשיקום היכולת להרכיב פלאק של לפאגים רקומביננטי. עם זאת, אסטרטגיה זו ניסיוני הוא שילוב מייגע צעדים בדרך עקיפה. כדי לטפל אזהרות כאלה, assay תיוג-הסוף עקיף דרום מבוסס כתם, אשר מכמת את פעילות IVI הקשורים PIC כאמצעי של vDNA אנדוגני משולב DNA phiX174 בקטריופאג לינארית אקסוגניים, פותח 6, 7, 18. למרות בשיטה זו מספקת מדידה ישירה של אירועי אינטגרציה, כמויות גבוהות יחסי של הכנת PIC נדרשות, אשר נשארה מאתגר מבחינה טכניתמַאֲמָץ. כדי לעקוף זאת, מבחני PCR מבוססי מקוננות המחייב רק כמויות צנועות של תמונות פותחו 4, 5, 19.
בדו"ח זה, אנו מתארים גרסה מעודכנת של PCR מבוסס מקוננות שיטה במבחנה המציאה כדי לשחזר את פעילות אינטגרצית HIV-1 PIC בתיווך המתרחשת בזמן הדבקה טבעית. שיטה זו משתמשת תמציות cytoplasmic של תאי יעד HIV-1-נגועים כמקור פעילות PIC האנדוג'ינוס נמדד עם תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qPCR). הנהלים לבידוד תמונות מדידים פעילויות האינטגרציה שלהם מותאמים, עם שינויים, מתוך פרוטוקולים שפורסמו על ידי מעבדת אנגלמן 20. בשיטה זו, פעילות האינטגרציה הקשורים PIC היא שיזמה מתן DNA היעד ליניארי אקסוגניים 21, ואת מוצרי DNA הנובעיםתגובת שילוב הזה הוא מטוהר ושמשה החומר המוצא של כימותים מבוססים PCR הבא. בשנות ה PCR קונבנציונאלי בסיבוב הראשון, הצמתים DNA הנגיפי-היעד הם מוגבר באמצעות פריימרים מתאימים. ב-הסיבוב השני qPCR, פריימרים ספציפיים LTR משמשים להעשרת האוכלוסייה vDNA במיוחד מן המוצרים PCR-בסיבוב הראשון. נא עיין בסעיף פרוטוקול תיאור מפורט של שיטה זו.
במחקרים במבחנה עם התמונות retroviral הובילו להתקדמות משמעותית להבנתנו את מנגנון האינטגרציה DNA retroviral ו בפיתוח מעכבי IN. בהתבסס על ההתמקדות ההולכת וגוברת לאחרונה באתרי אינטגרציה HIV-1 מיפוי, בקביעת התפקיד של גורמים נגיפיים המארח אינטגרצית HIV-1, ופיתוח תרופות אנטי חדשות כלפי במאבק עמיד לתרופות, אנחנו מדמיינים התעניינות מוגברת ואת שימוש נרחב של מבחני IVI , כמו זה המתואר בדו"ח זה. זה, בתורו, יביאחידודים בעתיד בשיטה, ובכך לגוון את טווח היישומים שלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוחים ביוכימיים של התמונות retroviral סיפקו תובנות קריטיות לתוך מנגנון של אינטגרציה DNA retroviral. מדידה של פעילות האינטגרציה של תמונות retroviral יכולה להיות מושגת על ידי assay היווצרות הפלאק, ניתוח כתם דרום המקונן qPCR. האסטרטגיה ניסיון של assay פלאק היא מייגע מנצלת שיטה עקיפה למדידת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענקים DA024558, DA30896, DA033892, ו DA021471 מן NIDA / NIH לתקליטור. אנחנו גם מכירים את G12MD007586 מענק RCMI, ואנדרבילט CTSA להעניק UL1RR024975, מרכז המחקר Translational Meharry (MeTRC) CTSA RR026140 U54 מענק מטעם NCRR / NIH, MD007593 מענק U54 מן NIMHD / NIH, ואת AI110527 P30 מענק טנסי וכפר.
Materials
|
Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
|
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
|
PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
|
DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
|
Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
|
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
|
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
|
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
|
|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
|
Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
|
Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
|
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
References
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
- Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
- Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
- Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration–mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
- Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
- Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
- Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
- Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
- Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
- Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
- Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
- Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
- Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).
