Medição de<em> In Vitro</em> Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

proteínas de HIV-1 envelope envolver receptores cognatos na superfície da célula-alvo, o que leva a fusão da membrana da célula virai seguida pela libertação do núcleo da cápside virai (CA) para o citoplasma. Subsequentemente, a transcriptase reversa virai (RT), como parte de um complexo homónimo nucleoproteína denominado o complexo Transcrição Reversa (RTC), converte o genoma de ARN viral de cadeia simples em uma cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Isto leva a biogénese de outro complexo de nucleoproteínas, denominado o complexo de pré-integração (PIC), composto do vDNA e proteínas de vírus associados e factores do hospedeiro. A integrase viral associada-PIC (EM) orquestra a integração do vDNA no ADN cromossómico do hospedeiro em um processo de duas etapas espacialmente e temporalmente regulado. Em primeiro lugar, o nos processos de extremidades 3 'do vDNA no citoplasma e, em segundo lugar, após o PIC trafica para o núcleo, que medeia a integração do vDNA processado no ADN cromossómico. Os PICs isoladoa partir de células-alvo infectados de forma aguda com HIV-1 são funcionais in vitro, uma vez que são competentes para integrar o vDNA associado num ADN alvo heterólogo adicionado exogenamente. Tal-PIC com base em ensaios in vitro de integração têm contribuído significativamente para delinear os detalhes mecanicistas de integração retroviral e descobrindo em inibidores. Neste relatório, nós elaboramos sobre um ensaio PIC HIV-1 actualizado que emprega uma estratégia baseada aninhada em tempo real Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR) para medir a atividade de integração in vitro de PICs nativas isoladas.

Introduction

Replicação de HIV-1 na célula alvo envolve vários passos, agrupadas em duas fases: eventos precoces e tardias. Os eventos iniciais começam quando o HIV-1 liga-se a sequência do receptor de superfície da célula alvo CD4 e um dos dois co-receptores (CCR5 ou CXCR4) ^1. Por conseguinte, o fusível membranas de células com vírus, e a cápside virai (CA) do núcleo é libertado para o citoplasma ^2. O núcleo CA contenha o ARN virai genómico de cadeia simples (ssRNA) e várias proteínas, tanto virais e celulares na origem. As proteínas virais associadas-CA incluem Transcriptase Reversa (RT) e da integrase (IN), duas enzimas que medeiam passos críticos durante eventos precoces da replicação viral. A RT e IN função no contexto de complexos nucleoproteicos, nomeadamente a transcrição reversa Complexo (RTC) e o complexo de pré-integração (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. As extremidades do genoma viral ssRNA terminal do porto de repetição (R) elementos adjacentes às sequências U5 única (na extremidade 5 ') e U3 (na extremidade 3'). O RTC converte o genoma viral num ssRNA (DS) de cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Este processo de transcrição reversa também resulta na duplicação das sequências U5 e U3, gerando, assim, repetições terminais longas (LTR) em ambas as extremidades do vDNA ^{7, 8.} Subsequentemente, o EM-associado PIC catalisa duas reacções bioquímicas sequenciais que permitem a integração do vDNA no cromossoma do hospedeiro ^{9, 10, 11.} Em primeiro lugar, no citoplasma, EM multímeros envolver ambas as LTRs ¹² e clivar um dinucleótido de cada uma das extremidades 3 '-terminal. Este processamento de extremidade 3 'gera um grupo hidroxilo em cada extremidade 3' (CA _OH) do vDNA.Em seguida, o PIC trafica para o núcleo, em que utiliza o vDNA CA _OH como um nucleófilo para cortar ambas as cadeias do ADN cromossómico de forma escalonada. Simultaneamente, EM coordenadamente emendas de ambas as extremidades do vDNA para as ligações fosfodiéster que resultam em cadeias opostas do ADN cromossómico. Após este passo de transferência de cadeia, a maquinaria da célula hospedeira remove os dois nucleótidos desemparelhados nas extremidades 5 'do vDNA e repara as consequentes lacunas de cadeia simples na junção do local de integração. Os eventos iniciais, assim, culminar com a criação de uma cópia de DNA integrado (provírus) do HIV-1 genoma. O provírus proporciona um ambiente apropriado para a expressão do gene virai eficiente, o que inicia os eventos posteriores, incluindo a expressão das proteínas codificadas por vírus; montagem do vírus imaturo; e brotação, release, e maturação em viriões infecciosos ^13.

Purificada IN retroviral recombinante é competente pararealizar, in vitro, ambas as atividades de processamento e transferência de cadeia 3'-end em exogenamente fornecido DNA substrato LTR-like. Os estudos bioquímicos usando tais IN recombinante purificada revelaram aspectos críticos da integração vDNA ^{14, 15, 16, 17.} No entanto, ao contrário da infecção natural, esta reacção bioquímica in vitro não suporta integração combinada de ambas as extremidades do ADN substrato para a DNA-alvo. Em contraste, os PICs retrovirais isolados a partir de células infectadas de forma aguda concertadamente integrar ambas as extremidades do vDNA endógena no ADN alvo heterólogo. Isto levou à adopção generalizada e refinamentos subsequentes de ensaios in vitro Integração (IVI) I n usando PICs nativas isoladas.

No primeiro ensaio relatado retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas com um recombinante de murinoVírus da Leucemia (MLV) que alberga o gene de E. coli supF na sua LTR serviu como fonte de actividade em, e o ADN de um fago lambda mutante defeituoso no crescimento lítico foi fornecido exogenamente como o ADN alvo. A integração bem sucedida do ADN recombinante MLV copiar para o ADN de fago e a expressão consequente supF levou a restauração da capacidade de formação de placas de fagos recombinantes. No entanto, esta estratégia experimental é a integração trabalhoso e medidas de forma indireta. Para lidar com estas advertências, um ensaio de marcação terminal indirecta à base de Southern blot, que quantifica a actividade associada IVI-PIC como uma medida da vDNA endógena exógeno integrado no bacteriófago linearizado phiX174 ADN, foi desenvolvido ^{6, 7, 18.} Embora este método proporciona uma medida directa de eventos de integração, quantidades relativamente elevadas de preparação PIC são necessários, o que continua a ser um desafio técnicoesforço. Para contornar isso, aninhados ensaios baseados em PCR que exigem apenas quantidades modestas de PICs foram desenvolvidos ^{4, 5, 19.}

Neste relatório, nós descrevemos uma versão atualizada de um nested PCR baseado no método in vitro concebido para recapitular a atividade de integração do HIV-1 PIC-mediada que ocorrem durante a infecção natural. Este método utiliza os extractos citoplasmáticos de células alvo de HIV-1-infectadas como uma fonte de actividade PIC endógena, que é medido com um tempo real Polimerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Os procedimentos para isolar PICs e medir suas atividades de integração são adaptados, com modificações, a partir de protocolos publicados pelo laboratório Engelman ^20. Neste método, a actividade de integração associada-PIC é iniciado, fornecendo um ADN alvo exógeno linear ^21, e os produtos de DNA resultantesesta reacção integração são purificados e utilizados como material de partida para a quantificação baseado no PCR subsequente. Na primeira ronda de PCR convencional, as junções de ADN viral-alvo são amplificados utilizando iniciadores apropriados. Na segunda rodada qPCR, primers específicos de LTR são usadas para enriquecer especificamente a população vDNA do primeiro turno produtos de PCR. Por favor, consulte a seção de protocolo para uma descrição detalhada deste método.

Estudos in vitro com PICs retrovirais têm conduzido a avanços significativos na compreensão do mecanismo de integração de ADN retroviral e no desenvolvimento de inibidores de NOS. Com base na recente foco maior sobre mapeamento de HIV-1 sites de integração, determinar o papel dos fatores virais e do hospedeiro na HIV-1 integração e desenvolvimento de novas drogas antivirais para o combate à resistência aos medicamentos, prevemos um aumento do interesse e uso generalizado de ensaios IVI , como o descrito no presente relatório. Este, por sua vez, levará afuturos aperfeiçoamentos no método, diversificando assim o alcance de suas aplicações.

Protocol

Produção 1. Vírus NOTA: Para gerar títulos elevados de VIH-1 infeccioso, transfectar a linha celular de rim embrionário humano (HEK) 293T com um clone molecular infeccioso do HIV-1 usando um reagente de transfecção à base de dendrímero activado. Tem sido observado que o método de transfecção com fosfato de cálcio produz resultados comparáveis. Em um laboratório de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2), semente de 3 x 10 6 293T células por placa de 10 cm …

Representative Results

O isolamento do VIH-1 PICs Um esquema do protocolo usado para o isolamento de PICs do VIH-1 a partir de células SUP-T1 infectados de forma aguda é representada na Figura 1. Este protocolo é derivado a partir dos métodos descritos por Engelman et ai. 19, 20. PICs do VIH-1 são complexos nucleoproteicos que são montados em …

Discussion

análises bioquímicas de PICs retrovirais têm proporcionado uma visão crítica sobre o mecanismo de integração do DNA retroviral. Medição da actividade de integração de PICs retrovirais pode ser conseguida por ensaio de placas de formação, a análise de mancha de Southern, e nested qPCR. A estratégia experimental do ensaio de placa é trabalhoso e utiliza um método indirecto para medir a integração ^{6, 7, 18.} Inte…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862