Измерение<em> In Vitro</em> Интеграция активность ВИЧ-1 Preintegration Комплексы

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

ВИЧ-1 белки оболочки участвовать родственные рецепторы на поверхности клетки-мишени, что приводит к слиянию мембран вирусной клеток с последующим выделением ядра вирусный капсид (СА) в цитоплазму. Впоследствии обратной транскриптазы вируса (RT), как часть одноименным нуклеопротеидную комплекса называется обратной транскрипцией комплекс (РТК), преобразует вирусную одноцепочечной РНК-геном в копию двухцепочечной ДНК (vDNA). Это приводит к биогенезе другого нуклеопротеидной комплекса, называемый предварительно интеграционного комплекса (PIC), состоящий из vDNA и ассоциированных вирусных белков и факторов организма. PIC-ассоциированный вирусный интегразы (IN) оркеструет интеграции vDNA в хромосомной ДНК хозяина в во времени и пространстве регулируется двухступенчатого процесса. Во-первых, в процессах концы 3 'в vDNA в цитоплазму и, во-вторых, после того, как ПИК трафиков к ядру, он опосредует интеграцию обработанного vDNA в хромосомную ДНК. В ОСТО изолированныеот клеток – мишеней , остро инфицированных ВИЧ-1 , являются функциональными в лабораторных условиях , так как они компетентны интегрировать соответствующий vDNA в экзогенно добавленного гетерологичной ДНК – мишени. Такой PIC на основе анализов в пробирке интеграции в значительной мере способствовали разграничению механистические детали ретровирусной интеграции и обнаружения ингибиторами. В этом докладе мы подробно остановимся на обновленном ВИЧ-1 ПОС анализа , в которой используется -На стратегию вложенная в реальном масштабе времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для измерения интеграции активности в пробирке изолированных коренных ТОС.

Introduction

ВИЧ-1 репликации в клетке-мишени включает в себя несколько этапов, в широком смысле, сгруппированных в два этапа: ранние и поздние события. Ранние события начинают , когда ВИЧ-1 последовательно связывается с поверхностным рецептором клетки – мишени CD4 и один из двух корецепторами (CCR5 или CXCR4) ^1. Следовательно, вирус-клеточных мембран взрыватель, и вирусный капсид (СА) ядро высвобождается в цитоплазму ^2. Ядро СА содержит вирусную геномную одноцепочечной РНК (ssRNA) и несколько белков, как вирусными и клеточными по своему происхождению. CA-ассоциированных вирусные белки включают обратной транскриптазы (RT) и интегразы (IN), двух ферментов, которые опосредуют важные шаги в ходе ранних событий в репликации вируса. RT и IN функции в контексте нуклеопротеидных комплексов, а именно с обратной транскрипцией комплекс (РТК) и пре-интеграционного комплекса (ПОС), соответственно ^{3, 4, 5} <SUP>, ^6. Концы вирусного генома ssRNA гавани концевого повтора (R) элементов примыкающие к уникальной последовательности U5 (на 5'-конце) и U3 (на 3'-конце). RTC преобразует вирусный геном ssRNA в двухцепочечной (DS) ДНК-копии (vDNA). Этот обратный процесс транскрипции также приводит к дублированию U5 и U3 последовательностей, таким образом , генерируя длинные концевые повторы (LTR) на обоих концах vDNA ^{7, 8.} Впоследствии КВС-ассоциирована в катализирует два последовательных биохимических реакций , которые позволяют интеграцию vDNA в хромосому хозяина ^{9, 10, 11.} Во- первых, в цитоплазме, В мультимеры участвовать оба Ltrs ¹² и расщепляют динуклеотид от каждого из 3'-концевых. Этот 3'-конце обработки генерирует гидроксильную группу на каждом 3'-конце (CA _ОН) от vDNA.Затем ПИК трафиков к ядру, где в использует vDNA CA _ОН в качестве нуклеофильного агента, чтобы отрезать обе нити хромосомной ДНК в шахматном порядке. Одновременно в координационно сростков оба конца vDNA к результирующим фосфодиэфирной связи на противоположных нитей в хромосомную ДНК. После этой стадии переноса цепи, клетка-хозяин машины удаляет два неспаренных нуклеотида на концах 5 'vDNA и ремонт вытекающие отсюда одноцепочечные пробелы на стыке сайта интеграции. Первые события, таким образом, завершаются с созданием интегрированной ДНК-копии (провирусной) от ВИЧ-1 генома. Провирус обеспечивает подходящую среду для эффективной экспрессии вирусного гена, который инициирует последующие события, в том числе экспрессию вирусных-кодируемых белков; сборка незрелого вируса; и подающий надежды, выпуск и созревание в инфекционных вирионов ^13.

Очищенный рекомбинантный ретровирусный В компетентенпроводить в лабораторных условиях , оба вида деятельности для обработки и переноса цепи 3'-конец на экзогенно ДНК LTR-как субстрат. Биохимические исследования с использованием такого очищенного рекомбинантного IN выявили критические аспекты vDNA интеграции ^{14, 15, 16, 17.} Тем не менее, в отличие от естественной инфекции, эта биохимическая реакция в пробирке не поддерживает согласованную интеграцию обоих концов субстратной ДНК в ДНК – мишени. В противоположность этому, ретровирусные ТОС, выделенные из остро инфицированных клеток скоординированно интегрировать оба конца эндогенных vDNA в гетерологичной ДНК-мишени. Это привело к широкому распространению и последующих уточнений Vitro интеграции (IVI) анализов I N с использованием выделенных родных ОСТО.

В первом сообщалось ретровирусов IVI анализа цитоплазматические экстракты из клеток, инфицированных рекомбинантным мышинойЛейкоз Вирус (MLV) укрывает ген кишечной палочки supF в его LTR служил в качестве источника активности IN, и ДНК мутантного фага лямбда неполноценный в литического роста был экзогенно в качестве ДНК – мишени. Успешная интеграция рекомбинантной ДНК MLV скопировать в ДНК фага и последующее supF выражение привело к восстановлению бляшкообразующих способности рекомбинантных фагов. Тем не менее, эта стратегия эксперимента является трудоемким и меры по интеграции косвенным образом. Для решения таких предостережений, Южный непрямое мечение по концам блот на основе, которая квантифицирует ПИК-ассоциированной IVI деятельности в качестве меры эндогенных vDNA интегрированной в экзогенный Линеаризованная бактериофага PHIX174 ДНК, была разработана ^{6, 7, 18.} Хотя этот метод обеспечивает прямое измерение интеграционных мероприятий, относительно высокие количества препарата ПОС необходимы, которая остается сложной техническистремиться. Чтобы обойти это, гнездовой ПЦР на основе анализов , требующих лишь скромные суммы ОСТО были разработаны ^{4, 5, 19.}

В этом докладе мы описываем обновленную версию вложенной ПЦР на основе в пробирке методом изобретенной резюмировать ВИЧ-1 PIC-опосредованного интеграции деятельности , происходящих во время естественной инфекции. Этот метод использует цитоплазматические экстракты ВИЧ-1-инфицированных клеток-мишеней в качестве источника эндогенного PIC активности, которая измеряется в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). Процедуры выделения ОСТО и измерения их деятельности по интеграции адаптированы, с изменениями, из протоколов , опубликованных в лаборатории Engelman ^20. В этом методе, интегрирование активности ПОС-ассоциированной инициируется путем создания ДНК – мишени экзогенной линейный ^21, и продукты ДНК в результатеэта реакция интеграции очищают и используют в качестве исходного материала для последующего ПЦР-квантификации. В первом раунде обычной ПЦР, стыки ДНК вирусно-мишени амплифицируют с использованием соответствующих праймеров. Во втором раунде КПЦР, LTR-специфические праймеры используются специально обогащают популяцию vDNA от первого раунда ПЦР-продуктов. Пожалуйста, смотрите раздел протокола для подробного описания этого метода.

В пробирке исследования с ретровирусных ОСТО привели к значительному прогрессу в понимании механизма интеграции ретровируса ДНК и в разработке ингибиторов IN. На основе недавнего повышенного внимания отображение ВИЧ-1 интеграции сайтов, определение роли вирусных и принимающих факторов у ВИЧ-1 интеграции, а также разработки новых противовирусных препаратов на борьбу с лекарственной устойчивостью, мы предусматриваем повышенный интерес и широкое применение IVI анализов , как описанный в настоящем докладе. Это, в свою очередь, приведет кбудущих уточнений в методе, таким образом, диверсифицировать сферу ее применения.

Protocol

1. Вирус Производство Примечание: Для генерации высокие титры инфекционного ВИЧ-1, трансфекции клеточной линии эмбриональной почки человека (НЕК) 293T с инфекционным ВИЧ-1 молекулярного клона с использованием активированного дендримера на основе реагента для трансфекции. ?…

Representative Results

Выделение ВИЧ-1 ОСТО Схема протокола , используемого для изоляции ВИЧ-1 ОСТО из остро инфицированных клеток Sup-T1 изображен на рисунке 1. Этот протокол является производным от методов , описанных Engelman и соавт. <sup class=…

Discussion

Биохимические анализы ретровирусных ОСТО обеспечили критические идеи в механизм ретровируса интеграции ДНК. Измерение активности интеграции ретровирусных ТОС может быть достигнута с помощью зубного налета анализа формирования, Саузерн-блот-анализа, и гнездовой кПЦР. Экспериментал?…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862