का नाप<em> इन विट्रो</em> एचआईवी -1 Preintegration परिसर की एकता गतिविधि
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
एचआईवी -1 लिफाफा प्रोटीन लक्ष्य कोशिका की सतह, जो वायरल-कोशिका झिल्ली संलयन कोशिका द्रव्य में वायरल capsid (सीए) कोर की रिहाई के द्वारा पीछा करने के लिए सुराग पर आत्मीय रिसेप्टर्स संलग्न हैं। बाद में, वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी), एक हमनाम nucleoprotein परिसर का हिस्सा के रूप में कहा रिवर्स प्रतिलेखन कॉम्प्लेक्स (आरटीसी), एक डबल असहाय डीएनए प्रतिलिपि (vDNA) में वायरल एकल असहाय आरएनए जीनोम धर्मान्तरित। यह एक और nucleoprotein परिसर के जीवजनन की ओर जाता है, पूर्व एकीकरण जटिल (पीआईसी), vDNA और जुड़े वायरस प्रोटीन और मेजबान कारकों से बना करार दिया। PIC जुड़े वायरल इंटिग्रेस (में) एक अस्थायी और स्थानिक विनियमित दो कदम प्रक्रिया में मेजबान गुणसूत्र डीएनए में vDNA के एकीकरण orchestrates। सबसे पहले, कोशिका द्रव्य में vDNA के 3 'सिरों संसाधित करता है और, दूसरा, के बाद PIC नाभिक को traffics, यह गुणसूत्र डीएनए में संसाधित vDNA के एकीकरण मध्यस्थता करता है। Pics का अलग-थलगलक्ष्य कोशिकाओं तीव्रता से एचआईवी -1 से संक्रमित से, इन विट्रो में कार्य कर रहे हैं के रूप में वे एक exogenously जोड़ा heterologous लक्ष्य डीएनए में जुड़े vDNA एकीकृत करने के लिए सक्षम हैं। इस तरह के PIC आधारित इन विट्रो एकीकरण assays में काफी रेट्रोवायरल एकीकरण के यंत्रवत विवरण का वर्णन करने के लिए और अवरोधकों में खोज करने के लिए योगदान दिया है। इस रिपोर्ट में, हम एक अद्यतन एचआईवी -1 PIC परख है कि पृथक मूल निवासी pics के लिए इन विट्रो एकीकरण गतिविधि को मापने के लिए एक नेस्टेड वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) आधारित रणनीति को रोजगार पर प्रकाश डालेंगे।
Introduction
जल्दी और देर घटनाओं: लक्ष्य सेल में एचआईवी -1 प्रतिकृति कई कदम, मोटे तौर पर दो चरणों में बांटा शामिल है। प्रारंभिक घटनाओं शुरू जब एचआईवी -1 क्रमिक रूप से लक्ष्य कोशिका की सतह रिसेप्टर सीडी 4 और दो सह-रिसेप्टर्स (CCR5 या CXCR4) 1 में से एक को बांधता है। नतीजतन, वायरस-कोशिका झिल्ली फ्यूज, और वायरल capsid (सीए) कोर कोशिका द्रव्य 2 में जारी की है। सीए कोर वायरल जीनोमिक एकल असहाय शाही सेना (ssRNA) और कई प्रोटीन, दोनों वायरल और मूल में सेलुलर शामिल हैं। सीए जुड़े वायरल प्रोटीन रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) और इंटिग्रेस (IN), दो एंजाइमों कि वायरल प्रतिकृति में जल्दी घटनाओं के दौरान महत्वपूर्ण कदम मध्यस्थता शामिल हैं। आर टी और nucleoprotein परिसरों, अर्थात् रिवर्स प्रतिलेखन कॉम्प्लेक्स (आरटीसी) और पूर्व एकीकरण जटिल (पीआईसी) क्रमश: 3, 4, 5 के संदर्भ में समारोह में <sup>, 6। वायरल जीनोम ssRNA बंदरगाह टर्मिनल दोहराने (आर) अद्वितीय दृश्यों U5 से सटे तत्वों (5 पर 'अंत) और U3 (3 पर' अंत) के सिरों। आरटीसी एक डबल असहाय (डी एस) डीएनए प्रतिलिपि (vDNA) में वायरल जीनोम ssRNA धर्मान्तरित। यह रिवर्स प्रतिलेखन प्रक्रिया भी U5 और U3 दृश्यों का दोहराव में यह परिणाम है, इस प्रकार vDNA 7, 8 के दोनों सिरों पर लंबे टर्मिनल दोहराता (लीटर) पैदा होता है। इसके बाद, तस्वीर जुड़े में दो अनुक्रमिक जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि मेजबान गुणसूत्र 9, 10, 11 में vDNA के एकीकरण सक्षम उत्प्रेरित। सबसे पहले, कोशिका द्रव्य में, multimers में दोनों लीटर 12 संलग्न हैं और 3'-टर्मिनल सिरों में से प्रत्येक से एक डाईन्यूक्लियोटाइड फोड़ना। इस 3'अंत प्रसंस्करण प्रत्येक 3'अंत vDNA की (CA OH) में एक हाइड्रॉक्सिल समूह उत्पन्न करता है।अगले, तस्वीर, नाभिक को traffics जिसमें में vDNA सीए ओह उपयोग करता है एक nucleophile के रूप में एक कंपित फैशन में गुणसूत्र डीएनए के दोनों किस्में कटौती करने के लिए। इसके साथ ही, में coordinately गुणसूत्र डीएनए के विपरीत किस्में पर जिसके परिणामस्वरूप phosphodiester बांड के लिए vDNA के दोनों सिरों splices। इस कतरा हस्तांतरण कदम के बाद, मेजबान सेल मशीनरी एकीकरण साइट के जंक्शन पर vDNA के 5 'समाप्त होता है और मरम्मत आगामी एकल असहाय अंतराल पर दो अयुगल न्यूक्लियोटाइड हटा। प्रारंभिक घटनाओं इस प्रकार एचआईवी -1 जीनोम का एक एकीकृत डीएनए प्रतिलिपि (provirus) की स्थापना के साथ culminate। provirus कुशल वायरल जीन अभिव्यक्ति है, जो वायरस इनकोडिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित बाद की घटनाओं, शुरू की के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान करता है; अपरिपक्व वायरस के विधानसभा; और नवोदित, रिहाई, और संक्रामक virions 13 में परिपक्वता।
शुद्ध पुनः संयोजक रेट्रोवायरल में करने के लिए सक्षम हैबाहर ले जाने, इन विट्रो में, दोनों 3'अंत प्रसंस्करण और कतरा हस्तांतरण गतिविधियों पर exogenously आपूर्ति की लीटर की तरह सब्सट्रेट डीएनए। इस तरह शुद्ध में पुनः संयोजक का उपयोग कर जैव रासायनिक अध्ययन vDNA एकीकरण 14, 15, 16, 17 के महत्वपूर्ण पहलुओं को उजागर किया है। हालांकि, प्राकृतिक संक्रमण के विपरीत, इस लिए इन विट्रो जैव रासायनिक प्रतिक्रिया लक्ष्य डीएनए में सब्सट्रेट डीएनए के दोनों सिरों के ठोस एकीकरण का समर्थन नहीं करता। इसके विपरीत, तीव्रता से संक्रमित कोशिकाओं से अलग रेट्रोवायरल PICs concertedly heterologous लक्ष्य डीएनए में अंतर्जात vDNA के दोनों सिरों को एकीकृत। यह अलग मूल निवासी Pics का उपयोग करते हुए व्यापक अपनाने और मैं n इन विट्रो एकता (IVI) assays के बाद के शोधन के लिए नेतृत्व किया।
पहले में रेट्रोवायरल IVI परख, एक पुनः संयोजक Murine से संक्रमित कोशिकाओं से cytoplasmic अर्क सूचना दील्यूकेमिया वायरस (MLV) ने अपनी लीटर में ई कोलाई supF जीन को शरण देने में गतिविधि का स्रोत है, और एक उत्परिवर्ती लैम्ब्डा फेज अपघट्य विकास में दोषपूर्ण exogenously लक्ष्य डीएनए के रूप में आपूर्ति की गई थी की डीएनए के रूप में कार्य किया। पुनः संयोजक डीएनए MLV के सफल एकीकरण फेज डीएनए में कॉपी और आगामी supF अभिव्यक्ति पुनः संयोजक फगेस की पट्टिका के गठन की क्षमता की बहाली के लिए नेतृत्व किया। हालांकि, इस प्रयोगात्मक रणनीति एक अप्रत्यक्ष तरीके से श्रमसाध्य और उपायों एकीकरण है। इस तरह के निरंतर संबोधित करने के लिए, एक दक्षिणी धब्बा आधारित अप्रत्यक्ष अंत लेबलिंग परख है, जो अंतर्जात बहिर्जात linearized जीवाणुभोजी phiX174 डीएनए में एकीकृत vDNA का एक उपाय के रूप में PIC जुड़े IVI गतिविधि quantifies, 6 विकसित किया गया था, 7, 18। हालांकि इस विधि एकीकरण की घटनाओं का एक सीधा उपाय प्रदान करता है, तस्वीर तैयार करने के अपेक्षाकृत उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, जो एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई हैप्रयास। इस दरकिनार करने के लिए, नेस्टेड पीसीआर आधारित pics के केवल मामूली मात्रा में आवश्यकता होती है assays 4 विकसित किए गए, 5, 19।
इस रिपोर्ट में, हम का एक अद्यतन संस्करण का वर्णन एक विट्रो विधि एचआईवी -1 पीआईसी की मध्यस्थता एकीकरण गतिविधि प्राकृतिक संक्रमण के दौरान होने वाली पुनरावृत्ति करने के लिए तैयार में नेस्टेड पीसीआर आधारित। इस विधि अंतर्जात PIC गतिविधि का एक स्रोत है, जो एक वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) के साथ मापा जाता है के रूप में एचआईवी -1 से संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं के cytoplasmic अर्क का उपयोग करता है। Pics का अलग-थलग करने और उनके एकीकरण की गतिविधियों को मापने के लिए प्रक्रियाओं संशोधनों के साथ अनुकूलित कर रहे हैं, Engelman प्रयोगशाला 20 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल से। इस विधि में, तस्वीर जुड़े एकीकरण गतिविधि एक exogenous रेखीय लक्ष्य डीएनए 21, और डीएनए से उत्पन्न उत्पाद उपलब्ध कराने के द्वारा शुरू की हैइस एकीकरण प्रतिक्रिया शुद्ध और बाद पीसीआर आधारित मात्रा का ठहराव के लिए शुरू सामग्री के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। पहले दौर में पारंपरिक पीसीआर में, वायरल लक्ष्य डीएनए जंक्शनों उचित प्राइमरों का उपयोग करके परिलक्षित कर रहे हैं। दूसरे दौर में qPCR, लीटर विशिष्ट प्राइमरों विशेष पहले दौर पीसीआर उत्पादों से vDNA आबादी को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। कृपया इस विधि का एक विस्तृत विवरण के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग देखें।
रेट्रोवायरल pics के साथ इन विट्रो अध्ययन में रेट्रोवायरल डीएनए एकीकरण की व्यवस्था के बारे में हमारी समझ में और अवरोधकों के विकास में उल्लेखनीय प्रगति हुई है। , मानचित्रण एचआईवी -1 एकीकरण साइटों पर हाल ही में बढ़ा फोकस के आधार पर एचआईवी -1 एकीकरण में वायरल और मेजबान कारकों की भूमिका का निर्धारण, और दवा प्रतिरोध का मुकाबला करने की दिशा में नई एंटीवायरल दवाओं के विकास, हम में वृद्धि हुई ब्याज और IVI assays के व्यापक उपयोग की परिकल्पना की गई इस रिपोर्ट में वर्णित एक तरह। यह, बारी में, को बढ़ावा मिलेगाविधि में भविष्य के शोधन, जिससे उसके आवेदन के दायरे में विविधता लाने के।
Protocol
Representative Results
Discussion
रेट्रोवायरल pics के जैव रासायनिक विश्लेषण रेट्रोवायरल डीएनए एकीकरण की व्यवस्था में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। रेट्रोवायरल pics के एकीकरण गतिविधि का मापन पट्टिका गठन परख, दक्षिणी धब्बा विश्ले?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम आंशिक रूप से अनुदान DA024558, DA30896, DA033892, और DA021471 NIDA / एनआईएच सीडी से द्वारा समर्थित है। हम यह भी RCMI अनुदान G12MD007586 स्वीकार करते हैं, वेंडरबिल्ट सीटीएसए अनुदान UL1RR024975, Meharry ट्रांसलेशनल रिसर्च सेंटर NCRR / एनआईएच, NIMHD / एनआईएच से U54 अनुदान MD007593, और टेनेसी CFAR अनुदान P30 AI110527 से (MeTRC) सीटीएसए अनुदान U54 RR026140।
Materials
|
Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
|
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
|
PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
|
DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
|
Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
|
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
|
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
|
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
|
|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
|
Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
|
Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
|
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
References
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