Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Summary

Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d'une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l'interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).

Abstract

interactions protéine-protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement d'un organisme vivant. Une fois que l'interaction a été identifié et validé, il est nécessaire de caractériser au niveau structurel et mécaniste. Plusieurs méthodes biochimiques et biophysiques existent à cette fin. Parmi eux, l'anisotropie de fluorescence est une technique puissante utilisée notamment lorsque l'intensité de la fluorescence d'une protéine marqué par un fluorophore reste constant lors d'une interaction protéine-protéine. Dans cette technique, une protéine marqué par un fluorophore est excité avec une lumière polarisée verticalement, d'une longueur d'onde appropriée qui excite sélectivement un sous-ensemble des fluorophores en fonction de leur orientation par rapport au faisceau entrant. L'émission résultant a également une directivité dont la relation dans les plans verticaux et horizontaux définit anisotropie (r) comme suit: r = (I _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), où je _VV et je <sub> VH sont les intensités de fluorescence des composantes verticales et horizontales, respectivement. L'anisotropie de fluorescence est sensible à la diffusion d'un fluorophore, à savoir la taille moléculaire apparente d'un fluorophore attaché à une protéine, qui est modifiée lors de l'interaction protéine-protéine de rotation. Dans le présent texte, l'utilisation de l'anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier les interactions protéine-protéine a été illustrée pour traiter la liaison entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur de Allongement like-1 GTPase (EFL1). De façon classique, le marquage d'une protéine avec un fluorophore est réalisée sur les groupes thiol (cystéine) ou dans les groupes amino (extrémité N-terminale amine ou lysine) de la protéine. Cependant, SBDS possède plusieurs cysteines et lysines qui ne permettent pas le site d'étiquetage dirigé de celui-ci. Comme alternative, le colorant 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine a été utilisé pour marquer spécifiquement un motif tétracystéine, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys modifié par génie génétique dans l'extrémité C-terminale de la protéine recombinante SBDS. Montage des données expérimentales ont fourni des informations quantitatives et mécaniste sur le mode de liaison entre ces protéines.

Introduction

Les cellules contiennent une multitude de macromolécules biologiques qui interagissent en permanence les uns avec les autres. Cette association donne naissance à des complexes qui participent aux mécanismes cellulaires responsables de leur fonctionnement dans la transduction du signal, la régulation de l'expression génique et la migration cellulaire, entre autres. Toutes les interactions protéine-protéine qui se produisent dans une cellule comprennent un réseau connu sous le nom intéractome. Dans Saccharomyces cerevisiae plus de 70% de ses protéines se sont révélées avoir des partenaires qui interagissent ^1. Comprendre l'interactome d'une cellule et leurs fonctions de fournir des informations pertinentes sur la complexité et la diversité des organismes vivants. Plusieurs méthodes ont été décrites pour identifier et caractériser les interactions protéine-protéine. Différent haute grâce à des méthodes telles que mettre deux hybrides de levure ^2, protéine fragment complémentation essais ^3, la purification par affinité ⁴ couplée à la spectrométrie de masse et de protéines microarrays sont utilisés pour identifier une interaction ^5,6. Une fois identifié, il est nécessaire de le valider et cela peut varier au cas par cas. En règle générale, ces essais impliquent perturber l'interaction elle – même au niveau des membres individuels de la paire d'interaction, par exemple par délétion du gène ou de la surexpression d'une des protéines, puis la recherche de changements dans les propriétés ou la fonction de l'autre élément à la niveau cellulaire. Par la suite, des techniques biophysiques ⁷ sont utilisées pour caractériser les interactions protéine-protéine au niveau moléculaire. A cet effet, la structure des complexes de protéines sont déterminées par cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire et de cryo-microscopie électronique tandis que la calorimétrie et la spectroscopie de fluorescence sont utilisés pour décrire quantitativement et mécaniquement entre eux.

Dans ce travail, l'anisotropie de fluorescence a été utilisé comme une technique pour caractériser l'interaction entre la GTPase EFL1 et le SBDprotéine S. Ces protéines participent à la synthèse des ribosomes en favorisant la libération du facteur d'initiation eucaryote 6 à partir de la surface de la sous – unité 60S du ribosome ^8. La protéine SBDS est muté dans la maladie connue sous le nom maladie de shwachman ⁹ et agit comme un facteur d'échange de nucléotide guanine pour EFL1 diminuant son affinité pour le guanosine diphosphate ^10,11. mutations de la maladie dans SBDS abolissent l'interaction avec EFL1 et empêchent ainsi son activation.

L'anisotropie de fluorescence est couramment utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-acide nucléique-protéine ou un peptide. Elle est basée sur le principe selon lequel un fluorophore excité avec les résultats de la lumière polarisée dans une émission polarisée partiellement. L'anisotropie de fluorescence est définie par l'équation 1:

où je _VV et je _VH sont laintensités de fluorescence de la verticale _(VV) et horizontalement _(VH) polarisés émission lorsque l'échantillon est excité par la lumière polarisée verticalement ^12. L'anisotropie de fluorescence est sensible à des facteurs qui affectent la vitesse de diffusion du fluorophore de rotation et dépend de la température, la viscosité de la solution et la taille moléculaire apparent du fluorophore ainsi. La taille apparente d'une protéine contenant un fluorophore augmente quand il interagit avec une autre protéine et un tel changement peut alors être évalué en tant que changement dans l'anisotropie. Plus précisément, un fluorophore qui tourne lentement dans la solution par rapport à sa durée de vie de fluorescence aura une grande valeur I _VV et une petite valeur I _VH et ne seront donc présenter une anisotropie relativement importante. Pour fluorophores qui dégringolent rapidement par rapport à leur durée de vie de fluorescence, je _VV et je _VH serai semblable et leur valeur d'anisotropie sera faible ¹² </sup> (Figure 1). En outre, pour un bon signal d'anisotropie à la mesure du bruit, il est nécessaire d'avoir un fluorophore avec une durée de vie de fluorescence similaire au temps de corrélation de rotation de la molécule d'intérêt. Dans le cas contraire, il est impossible d'enregistrer avec précision la différence entre l'anisotropie de la protéine libre et que, dans le complexe. Par exemple, l'anisotropie d'une sonde fluorescente à une durée de vie proche de 4 nsec tels que la fluorescéine ou la rhodamine attachés à un composé de faible masse moléculaire de 100 Da est de 0,05. La liaison à une molécule de 160 kDa va augmenter sa valeur d'anisotropie à 0,29; une différence qui peut être mesuré avec précision. En revanche, la même sonde fluorescente impliquée dans une réaction de liaison dont l'augmentation de la taille moléculaire varie de 65 à 1000 kDa ne permettra d'obtenir un changement d'anisotropie de 0,28 à 0,3, ce qui est trop faible pour être mesurée avec précision. Dans ce scénario, une sonde avec une durée de vie de 400 nanosecondes serait plus approprié ^12.

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Figure 1. Représentation schématique de l'équipement utilisé pour mesurer l' anisotropie de fluorescence et de la procédure. Représentation schématique de l'équipement utilisé pour effectuer une anisotropie de fluorescence expérience d'interaction protéine-protéine de mesure. Fluorophores qui dégringolent rapide petit écran anisotropie qui augmente lors de la liaison à un partenaire d'interaction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

les applications de fluorescence nécessitent la présence d'un fluorophore dans une quelconque des molécules étudiées. Pour étudier les interactions protéine-protéine, il existe trois types de fluorophores: 1) les résidus tryptophane présents dans les protéines, 2) des fluorophores attachés chimiquement et 3) les partenaires de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses derivatives. La plupart des protéines ont des résidus de tryptophane dans sa structure, donc la meilleure façon de mesurer l'interaction est en surveillant les changements dans les spectres de fluorescence correspondants ou par la surveillance des changements dans l'intensité de fluorescence des résidus tryptophane. Cependant, les résidus tryptophane peuvent être présents dans les deux protéines qui compliquent l'analyse. D'autre part, pour un fluorophore pour modifier ses propriétés de fluorescence due à une interaction dont il a besoin d'être situé sur ou à proximité du site de liaison et il pourrait interférer avec l'interaction elle-même. Cela nécessite une attention particulière lors de l'utilisation de fluorophores volumineux tels que la GFP. Si aucune de ces fluorophores peut être utilisé pour des études de liaison, il est donc nécessaire d'introduire des fluorophores extrinsèques à l'une des protéines impliquées. De nombreux fluorophores synthétisés chimiquement existent et peuvent être fixés de manière covalente à des protéines par l'intermédiaire de leurs groupes réactifs tels que les groupes amine (chaîne latérale de résidus lysine ou N-terminale) et les groupes thiol dans la cystéine. Fles dérivés de luorophore avec de l' isothiocyanate et des esters de succinimidyle réagissent avec des groupes amide tandis que l' iodoacétamide et le maléimide sont des groupes thiol réactifs ^13. Les colorants les plus courants utilisés dans les applications de fluorescence sont des dérivés de la fluorescéine et les colorants verts rhodamine, les coumarines, les fluorophores BODIPY et colorants Alexa Fluor. Une liste détaillée des fluorophores disponibles dans le commerce et leur utilisation peut être trouvé dans les références ^14,15. Pour le marquage avec succès, le groupe réactif doit être exposée sur la surface de la protéine, mais en raison du grand nombre de groupes fonctionnels réactifs présents dans les polypeptides en général, il est très difficile d'obtenir une modification spécifique d'un site. La protéine d'intérêt dans cette étude, SBDS, contient 5 cysteines libres et 33 lysines qui peuvent résulter dans l'étiquetage des sites multiples. étiquetage non uniforme peut affecter la liaison et va compliquer l'analyse des données différentes molécules fluorophores peuvent provoquer différents signaux d'intensité fluorescente lors de la liaison. Pour overcome ce problème, nous avons utilisé le fluorophore FlAsH, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine à l'étiquette du site directement la protéine SBDS. Ceci est un colorant arsenoxide avec une forte affinité pour les quatre cysteines espacées dans un motif connu sous Flash tag comprenant le CCXXCC de séquence où X est un acide aminé autre que la cystéine ^16,17. Ce motif tétracystéine est ajouté à l'extrémité N- ou C-terminale de la protéine par génie génétique conjointement avec un agent de liaison approprié pour empêcher la rupture du pli général de la protéine. La paire composée de FlAsH colorant et FlAsH-tag a été initialement conçu pour les protéines d'étiquettes spécifiques au site dans les cellules ¹⁷ vivant , mais il peut aussi être utilisé pour marquer des protéines purifiées in vitro comme il est illustré ici. En outre, les stratégies enzymatiques ont également été mis au point pour permettre la fonctionnalisation spécifique au site des protéines ^18.

Dans ce manuscrit, nous décrivons l'utilité de l'anisotropie de fluorescence d'unoutil sa pour étudier les interactions protéine-protéine. Reliure peut être évaluée par une simple inspection de la forme de liaison de la courbe tandis que l'information quantitative peut être obtenue à partir de l'ajustement des données expérimentales.

Protocol

1. SBDS-Flash tag Protein Expression et purification Remarque: Pour les expériences d'anisotropie, un flash-étiquette correspondant à la séquence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys a été ajouté à l'extrémité C-terminale des séquences codantes humaines SBDS par PCR. Cette construction a été sous – cloné dans le vecteur d'expression présets-A et transformé en cellules C41 Escherichia coli pour exprimer une protéine codant pour une étiquette hexahistidine N-terminal (His-tag), les SBDS hum…

Representative Results

Pour effectuer toutes les expériences d'anisotropie, il est important d'éliminer les fortes variations dans l'intensité de fluorescence du fluorophore étant donné que l'anisotropie observée d'un mélange d'espèces est représenté par l'équation 5: où F i</…

Discussion

La plupart des expériences biochimiques avec les protéines ne nécessitent pas de protéine pure, mais aussi de grandes quantités d'entre eux, quelle que soit la technique utilisée. Pour cette raison, les protéines utilisées pour ce type d'expériences sont obtenues par expression hétérologue, comme ce fut le cas présenté ici. La spectroscopie de fluorescence nécessite la présence d'un fluorophore dans la molécule étudiée. des résidus aromatiques constituent les fluorophores intrinsèques d&#…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox