Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Summary

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Abstract

Protein-Protein-Interaktionen spielen eine wesentliche Rolle in der Funktion eines lebenden Organismus. Sobald eine Interaktion identifiziert und validiert ist es notwendig, sie auf die strukturelle und mechanistische Ebene zu charakterisieren. Mehrere biochemische und biophysikalische Methoden existieren für solche Zwecke. Unter ihnen ist Fluoreszenzanisotropie eine leistungsfähige Technik insbesondere verwendet, wenn die Fluoreszenzintensität eines Fluorophor-markierten Proteins konstant bleibt auf Protein-Protein-Interaktion. In dieser Technik wird ein Fluorophor markiertes Protein ist mit vertikal polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt, die selektiv eine Untergruppe der Fluorophore entsprechend ihrer relativen Orientierung mit dem ankommenden Strahl erregt. Die resultierende Emission hat auch eine Direktionalität , deren Beziehung in der vertikalen und horizontalen Ebenen definiert Anisotropie (r) wie folgt: r = (I _VV -I _VH) / (I + 2I _{VV VH),} wobei I _VV und I <sub> VH sind die Fluoreszenzintensitäten der vertikalen und horizontalen Komponenten, respectively. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber der Rotationsdiffusion eines Fluorophors, nämlich die scheinbare Molekülgröße eines Fluorophors an ein Protein gebunden, die auf Protein-Protein-Wechselwirkung verändert wird. In dem vorliegenden Text ist die Verwendung von Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu studieren, wurde beispielhaft die Bindung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und den Elongationsfaktor like-1-GTPase (EFL1) mutiert zu adressieren. Herkömmlicherweise Markierung eines Proteins mit einem Fluorophor ist auf der Thiol-Gruppen (Cystein) oder in den Aminogruppen (die N-terminale Amin oder Lysin) ausgeführt des Proteins. Allerdings besitzt SBDS mehrere Cysteine ​​und Lysine, die nicht ortsgerichtete Kennzeichnung es erlauben. Als alternative Technik, dem Farbstoff 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein wurde verwendet, spezifisch ein Motiv Tetracysteinmotiv zu etikettieren, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetisch in dem C-Terminus des rekombinanten Proteins SBDS konstruiert. Fitting der experimentellen Daten bereitgestellt quantitative und mechanistische Information über den Bindungsmodus zwischen diesen Proteinen.

Introduction

Zellen enthalten eine Vielzahl von Biomakromolekülen, die ständig miteinander in Wechselwirkung treten. Diese Vereinigung führt zu Komplexen, die in den zellulären Wege, die für ihre Funktion in der Signaltransduktion, die Regulation der Genexpression und der Zellmigration unter anderem teilnehmen. Alle Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in einer Zelle auftreten, umfassen ein Netzwerk wie das Interaktom bekannt. In Saccharomyces cerevisiae mehr als 70% ihrer Proteine wurden Interaktionspartner ¹ gezeigt zu haben. Das Verständnis der Interaktom einer Zelle und deren Funktionen liefern relevante Informationen über die Komplexität und Vielfalt der Lebewesen. Verschiedene Methoden wurden Protein-Protein-Interaktionen beschrieben zu identifizieren und zu charakterisieren. Verschiedene Hochdurchsatzverfahren, wie Hefe – Zwei-Hybrid – ² – Protein-Fragment Komplementierung Assays ^3, Affinitätsreinigung ⁴ gekoppelt mit der Massenspektrometrie und Protein microarrays verwendet ^5,6 eine Interaktion zu identifizieren. Einmal identifiziert, ist es notwendig, sie zu überprüfen und diese auf einer Fall-zu-Fall-Basis variieren. Typischerweise umfassen diese Versuche die Wechselwirkung selbst auf der Ebene der einzelnen Mitglieder des Wechselwirkungspaares zu stören, beispielsweise durch Gendeletion oder Überexpression eines der Proteine, und dann auf Änderungen in den Eigenschaften oder der Funktion des anderen Elements bei der Suche zellulärer Ebene. Anschließend werden biophysikalische Techniken ⁷ verwendet , um die Protein-Protein – Wechselwirkung auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck sind die Struktur von Protein-Komplexe, die durch Röntgenkristallographie bestimmt, kernmagnetische Resonanz und Kryo-Elektronenmikroskopie während Kalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, um quantitativ und sie mechanistisch beschreiben.

In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzanisotropie als eine Technik verwendet, um die Wechselwirkung zwischen dem GTPase EFL1 und der SBD zu charakterisierenS-Protein. Diese Proteine beteiligen sich an der Synthese von Ribosomen durch die Freisetzung von eukaryotischen Initiationsfaktor Förderung 6 von der Oberfläche der 60S ribosomalen Untereinheit ^8. Das SBDS Protein wird in einer Krankheit als Shwachman-Diamond – Syndrom ⁹ und wirkt als ein Guaninnukleotid – Austauschfaktor für EFL1 abnehm seine Affinität für Guanosindiphosphat ^10,11 bekannt mutiert. Krankheit Mutationen in SBDS die Interaktion mit EFL1 abzuschaffen und somit ihre Aktivierung verhindern.

Fluoreszenzanisotropie wird in biologischen Anwendungen zu untersuchen Protein-Peptid- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Sie basiert auf dem Prinzip, dass ein Fluorophor mit polarisiertem Licht führt zu einer teilweise polarisierte Emission angeregt. Fluoreszenzanisotropie wird durch Gleichung 1 definiert:

wo ich _VV und ich _VH sind dieFluoreszenzintensitäten des vertikal _(VV) und horizontal _(VH) polarisierte Emission , wenn die Probe angeregt wird , mit vertikal polarisiertem Licht ^12. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber Faktoren, die die Geschwindigkeit der Rotationsdiffusion des Fluorophors beeinflussen und somit abhängig von der Temperatur, der Viskosität der Lösung und die scheinbare Molekülgröße des Fluorophors. Die scheinbare Grße eines Proteins ein Fluorophor enthält, erhöht, wenn es mit einem anderen Protein und eine solche Änderung in Wechselwirkung kann dann als eine Änderung der Anisotropie ausgewertet werden. Genauer gesagt, der Wert und kleiner I _VH Wert mit einem großen I _VV und daher eine relativ große Anisotropie wird zeigen müssen ein Fluorophor, die sich langsam in Lösung relativ zu seiner Fluoreszenzlebensdauer dreht. Für Fluorophore, die sich schnell in Bezug auf ihre Fluoreszenzlebensdauer im Trockner, ich _VV und ich _VH wird wird ähnlich und ihre Anisotropie sein klein sein ¹² </sup> (Abbildung 1). Darüber hinaus ist für eine gute Anisotropie Signal-Rausch-Messung ist es notwendig, ein Fluorophor mit einer Fluoreszenzlebensdauer ähnlich der Rotationskorrelationszeit des Moleküls von Interesse zu haben. Andernfalls ist es nicht möglich, genau den Unterschied in der Anisotropie zwischen dem freien Protein aufnehmen, und dass in der Anlage. Zum Beispiel kann die Anisotropie einer fluoreszierenden Sonde mit einer Lebensdauer der Nähe von 4 nsec, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamin zu einer niedermolekularen Verbindung gebunden von 100 Da beträgt 0,05. Die Bindung an ein Molekül von 160 kDa seine Anisotropiewertes auf 0,29 zu erhöhen; ein Unterschied, der genau gemessen werden kann. Im Gegensatz dazu ging es um die gleiche Fluoreszenzsonde in einer Bindungsreaktion, deren Anstieg in Molekülgröße variiert von 65 bis 1.000 kDa führt nur in einer Anisotropie Änderung von 0,28 bis 0,3 ist, die zu klein ist, genau gemessen werden. In diesem Szenario wäre eine Sonde mit einer Lebensdauer von 400 ns mehr geeignet ^12.

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Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz – Anisotropie und die Prozedur. Schematische Darstellung der verwendeten Ausrüstung verwendet , um eine Protein-Protein – Wechselwirkung Experiment die Messung der Fluoreszenz – Anisotropie auszuführen. Fluorophore , die schnelle Anzeige geringe Anisotropie im Trockner , die bei der Bindung an einen Wechselwirkungspartner erhöht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fluoreszenzanwendungen erfordern das Vorhandensein eines Fluorophors in einem der untersuchten Moleküle. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt es drei Arten von Fluorophore: 1) die Tryptophan-Reste in den Proteinen, 2) chemisch gebunden Fluorophore und 3) fluoreszierende Fusionspartner wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) und dessen derivativen. Die meisten Proteine ​​haben Tryptophanreste auf seine Struktur und damit die einfachste Weg, um eine Interaktion zu messen, ist durch die Änderungen in dem entsprechenden Fluoreszenzspektren Überwachung oder durch Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Tryptophanreste zu überwachen. Jedoch können Tryptophanreste in beiden Proteinen vorhanden sein, die Analyse erschwert wird. Auf der anderen Seite, für ein Fluorophor aufgrund einer Wechselwirkung muss seine fluoreszierenden Eigenschaften ändern sie auf oder in der Nähe der Bindungsstelle lokalisiert werden und es könnte mit der Interaktion selbst stören. Dies erfordert besondere Aufmerksamkeit, wenn sperrige Fluorophore wie GFP verwenden. Wenn keine dieser Fluorophore können für Bindungsstudien verwendet werden, ist es notwendig, dann, um extrinsische Fluorophore an die eine der beteiligten Proteine ​​einzuführen. Viele chemisch synthetisierte Fluorophore existieren und können kovalent an Proteine ​​über ihre reaktiven Gruppen, wie den Amingruppen (Seitenkette von Lysinen oder N-Terminus) und die Thiolgruppen in Cystein gebunden sein. Fluorophore Derivate mit Isothiocyanat und Succinimidylester reagieren mit Amidgruppen während iodoacetamide und Maleimid sind thiolreaktives Gruppen ^13. Die am häufigsten verwendeten Farbstoffe in Fluoreszenzanwendungen verwendet werden, sind Derivate des Fluorescein und Rhodamin grüne Farbstoffe, Cumarine, BODIPY Fluorophore und Alexa Fluor Farbstoffe. Eine detaillierte Liste der im Handel erhältlichen Fluorophore und ihre Verwendung finden Sie in Referenzen ^14,15 gefunden werden. Für eine erfolgreiche Markierung muss die reaktive Gruppe auf der Oberfläche des Proteins exponiert werden, aber aufgrund der großen Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen typischerweise in Polypeptiden ist es sehr schwer ortsspezifische Modifikation zu erhalten. Das Protein von Interesse in dieser Studie SBDS, enthält 5 freie Cysteine ​​und 33 Lysine, die in mehreren Standorten Kennzeichnung führen kann. Uneinheitliche Kennzeichnung kann die Bindung beeinflussen und Datenanalyse komplizieren als unterschiedliche Fluorophormoleküle unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätssignale bei der Bindung auslösen kann. ÖVErcome dieses Problem haben wir den FlAsH Fluorophore, 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein orts direkt das SBDS Protein-Label. Dies ist ein arsenoxide Farbstoff mit einer hohen Affinität für vier beabstandete Cysteine in einem Motiv kennen als Flash-tag der Sequenz CCXXCC aus wobei X für jede Aminosäure außer Cystein ist ^16,17. Dieses Motiv wird Tetracysteinmotiv gentechnologisch zusammen mit einem geeigneten Linker an den N- oder C-Terminus des Proteins hinzugefügt, um die Störung des Gesamtfaltung des Proteins zu verhindern. Das Paar , das aus FlAsH Farbstoff und FlAsH-Tag wurde ursprünglich auf ortsspezifische Label Proteine entwickelt in lebenden Zellen ¹⁷ , sondern es kann auch gereinigte Proteine verwendet werden , in vitro zu beschriften , wie sie hier veranschaulicht wird. Zusätzlich haben enzymatische Strategien auch ¹⁸ ortsspezifische Funktionalisierung von Proteinen zu ermöglichen , entwickelt worden.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Nützlichkeit von Fluoreszenzanisotropiemessungen einsa Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bindung kann durch einfache Inspektion der Bindungskurvenform bewertet werden, während quantitative Informationen können aus der Anpassung der experimentellen Daten erhalten werden.

Protocol

1. SBDS-Flash Tag Proteinexpression und -reinigung HINWEIS: Für die Anisotropie Experimenten wurde eine FlAsH-tag entsprechend der Sequenz Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys an den C-Terminus des humanen SBDS hinzugefügt wurde durch PCR-codierende Sequenz. Dieses Konstrukt wurde der Expressionsvektor pRSET-A subkloniert und in Escherichia coli C41 – Zellen transformiert , um ein Protein exprimieren Codieren eines N-terminalen Hexahistidin – Tag (His-Tag), die menschlichen SBDS kodierenden Sequenz und einen C-Termi…

Representative Results

Auszuführen Experiment jede Anisotropie ist es wichtig, große Änderungen in der Fluoreszenzintensität des Fluorophors, um auszuschließen, da die beobachtete Anisotropie eines Gemisches von Spezies, die durch die Gleichung 5: wobei F i die fraktionierte Fluoreszenz jeder Kompone…

Discussion

Die meisten biochemischen Experimenten mit Proteinen erfordern nicht nur reines Protein, sondern auch große Mengen von ihnen unabhängig von der verwendeten Technik. Aus diesem Grund werden die Proteine ​​für diese Art von Versuchen verwendet werden, durch die heterologe Expression erhalten wird, wie es der Fall vorgestellt hier war. Florescence Spektroskopie erfordert die Anwesenheit eines Fluorophors in der untersuchten Moleküls. Aromatische Reste darstellen, die intrinsischen Fluorophoren eines Proteins jedoch…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox