Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Summary

Protein interaksjoner er i hjertet av en celle funksjon. Kalorimetriske og spektroskopiske teknikker blir ofte brukt for å karakterisere dem. Her beskriver vi fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere samspillet mellom protein mutert i Shwachman-Diamond syndrom (SBDS) og Forlengelse faktor-lignende en GTPase (EFL1).

Abstract

Protein-protein-interaksjoner spiller en viktig rolle i funksjonen av en levende organisme. Når en interaksjon har blitt identifisert og validert er det nødvendig å karakterisere den på det strukturelle og mekanistiske nivå. Mange biokjemiske og biofysiske metoder finnes for slike formål. Blant dem, er fluorescens anisotrofien en kraftfull teknikk spesielt anvendes når fluorescensintensiteten av en fluorofor-merket protein forblir konstant ved protein-protein-interaksjon. I denne teknikken er en fluorofor-merket protein eksiteres med vertikalt polarisert lys av en passende bølgelengde som selektivt eksiterer en undergruppe av fluoroforene i henhold til deres relative orientering i den innkommende strålen. Den resulterende utslipp har også en retnings hvis forhold i de vertikale og horisontale plan definerer anisotropi (r) som følger: r = (jeg _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), hvor jeg _vv og jeg <sub> VH er fluorescensstyrkene til de vertikale og horisontale komponenter, henholdsvis. Fluorescens anisotropi er følsom for rotasjons diffusjon av en fluorofor, nemlig den tilsynelatende molekylstørrelse på en fluorofor festet til et protein, som er endret ved protein-protein-interaksjon. I den foreliggende teksten, ble bruken av fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner eksemplifisert for å løse bindingen mellom proteinet mutert i den Shwachman-Diamond syndrom (SBDS) og forlengelsen faktor som-en GTPase (EFL1). Konvensjonelt blir merking av et protein med en fluorofor utført på tiolgrupper (cystein) eller i aminogruppene (N-terminale amin eller lysin) av proteinet. Men besitter SBDS flere cysteiner og lysines som ikke tillater nettstedet rettet merking av det. Som et alternativ teknikk, fargestoffet 4 ', ble 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein brukes for spesifikt å merke en tetracysteine ​​motiv, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetisk konstruert i den C-terminale ende av det rekombinante SBDS protein. Montering av eksperimentelle data gitt kvantitativ og mekanistisk informasjon om innbindingsmodus mellom disse proteinene.

Introduction

Celler inneholder et mangfold av biomacromolecules som hele tiden kommuniserer med hverandre. Denne assosiasjonen gir opphav til komplekser som deltar i de cellulære veier som er ansvarlige for deres funksjon i signaltransduksjon, regulering av genekspresjon og cellevandring blant andre. Alt protein-protein interaksjoner som forekommer i en celle omfatter et nettverk kjent som interactome. I Saccharomyces cerevisiae mer enn 70% av sitt protein har vist seg å ha samvirkende partnerne ^1. Forstå interactome av en celle og deres funksjoner gi relevant informasjon om kompleksiteten og mangfoldet av levende organismer. Flere metoder har blitt beskrevet å identifisere og karakterisere protein-protein interaksjoner. Forskjellig høy gjennom benyttet metoder som gjær to-hybrid ^2, protein-fragment komplemente assays ^3, affinitetsrensing ⁴ koblet til massespektrometri og protein microarrays brukes til å identifisere en interaksjon ^5,6. Når identifisert, er det nødvendig å validere det, og dette kan variere fra sak til sak. Vanligvis disse eksperimentene involverer forstyrre samspillet selv på nivå med de enkelte medlemmer av samspillet paret, for eksempel ved genet sletting eller overekspresjon av en av proteiner, og deretter se etter endringer i egenskaper eller funksjon av den andre medlemmet på cellenivå. Deretter blir biofysiske teknikker ⁷ som brukes til å karakterisere protein-protein interaksjon på molekylært nivå. For dette formål, er strukturen av proteinkomplekser bestemt ved røntgen-krystallografi, kjernemagnetisk resonans og kryo-elektronmikroskopi mens kalorimetri og fluorescens-spektroskopi blir brukt for å kvantitativt og mekanistisk beskrive dem.

I dette arbeidet ble fluorescens anisotropi brukt som en teknikk for å karakterisere samspillet mellom GTPase EFL1 og SBDS-proteinet. Disse proteinene deltar i syntesen av ribosomer ved å fremme frigivelse av eukaryotisk initiering faktor 6 fra overflaten av den 60S ribosomale subenhet ^8. Den SBDS proteinet er mutert på en sykdom som er kjent som den Shwachman-Diamond syndrom ⁹ og virker som et guanin nukleotid utveksling faktor for EFL1 avtagende dets affinitet for guanosin difosfat ^10,11. Sykdoms mutasjoner i SBDS avskaffe samspillet med EFL1 og dermed hindre aktivering.

Fluorescens anisotropi er ofte brukt i biologiske anvendelser for å studere protein-peptid eller protein-nukleinsyre-interaksjoner. Den er basert på det prinsipp at en fluoroforen eksiteres med polarisert lys resulterer i en delvis polarisert utslipp. Fluorescens anisotropi er definert ved ligning 1:

der jeg _vv og jeg _VH erfluorescensstyrkene den vertikalt _(VV) og horisontalt _(VH) polarisert utslipp når prøven er spent med vertikalt polarisert lys ^12. Fluorescens anisotropi er følsom for faktorer som påvirker frekvensen av rotasjons diffusjon av fluoroforen og således avhenger av temperaturen, viskositeten av løsningen og den tilsynelatende molekylstørrelse av fluoroforen. Den tilsynelatende størrelse av et protein inneholdende en fluorofor øker når den kommuniserer med et annet protein og en slik endring kan deretter evalueres som en endring i anisotropi. Nærmere bestemt vil en fluorofor som roterer langsomt i oppløsning i forhold til dets fluoriserende levetid vil ha en stor I _VV verdi og liten jeg _VH verdi, og derfor vil oppvise en forholdsvis stor anisotropi. For fluorophores som tørkes raskt i forhold til deres fluorescerende levetid, jeg _vv og jeg _VH vil være like og deres anisotropi verdien vil være liten ¹² </sup> (Figur 1). I tillegg, for en god anisotropi signal til støymåling, er det nødvendig å ha en fluorofor med en fluorescens levetid lik den rotasjonskorrelasjonstiden til molekylet av interesse. Ellers er det ikke mulig å nøyaktig registrere forskjellen i anisotrofien mellom den frie protein, og at i komplekset. For eksempel, anisotropien av en fluorescerende probe med en levetid nær 4 nsek som for eksempel fluorescein eller rhodamin festet til en lavmolekylær forbindelse med 100 Da er 0,05. Binding til et molekyl av 160 kDa vil øke dens anisotropi verdien til 0,29; en forskjell som kan måles nøyaktig. I motsetning til dette, vil det samme fluorescerende probe som er involvert i en bindingsreaksjon, som plutselig økning i molekylstørrelse varierer fra 65 til 1000 kDa bare resultere i en endring anisotropi på 0,28 til 0,3, noe som er for små til å måles nøyaktig. I dette scenariet vil en sonde med en levetid på 400 ns være mer egnet ^12.

<pclass = "jove_content">
Figur 1. Skjematisk representasjon av utstyret som brukes til å måle fluorescens anisotropi og prosedyren. Skjematisk representasjon av utstyret som brukes til å utføre en protein-protein interaksjon eksperiment som måler fluorescensen anisotropi. Fluoroforer som ristes rask visnings liten anisotropi som øker ved binding til et samspill partner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fluorescensanvendelser krever tilstedeværelse av en fluorofor i hvilket som helst av molekylene studert. For å undersøke protein-protein interaksjoner er det tre typer fluoroforer: 1) tryptofanrester som er tilstede i proteiner, 2) kjemisk festet fluoroforer og 3) fluoriserende fusjonspartnere som grønt fluorescerende protein (GFP) og dens derivatanter. De fleste proteiner har tryptofanrester på sin struktur, og dermed den enkleste måten for å måle en interaksjon er ved å overvåke endringene i den tilsvarende fluorescensspektra eller ved å overvåke endringer i fluorescens-intensiteten av tryptofanrester. Imidlertid kan tryptofanrester være til stede i begge proteiner kompliserer analysen. På den annen side, for en fluorofor til å endre sin fluoriserende egenskaper på grunn av en interaksjon det er behov for å være plassert på eller nær bindingssetet og det kunne interferere med interaksjonen selv. Dette trenger spesiell oppmerksomhet når du bruker store fluoroforer som GFP. Hvis ingen av disse fluoroforer kan brukes til bindingsstudier er det nødvendig, da, å innføre ytre fluoroforer til den ene av de involverte proteiner. Mange kjemisk syntetiserte fluoroforer eksistere og kan være kovalent bundet til proteiner via sine reaktive grupper slik som aminogrupper (sidekjede av lysin eller N-terminus) og tiol- grupper i cystein. Fluorophore derivater med isothiocyanate og suksinimidyl estere reagere med amidgrupper mens iodoacetamide og maleimide er tiol-reaktive grupper ^13. De mest vanlige fargestoffer som brukes i fluorescensanvendelser er derivater av fluorescein og rhodamin grønne farvestoffer, koumariner, BODIPY fluoroforer og Alexa Fluor fargestoffer. En detaljert liste over kommersielt tilgjengelige fluoroforer og deres anvendelse kan finnes i referanser ^14,15. For vellykket merking, må den reaktive gruppe være eksponert på overflaten av proteinet, men på grunn av det store antall reaktive funksjonelle grupper som typisk er tilstede i polypeptidene det er svært vanskelig å få sete-spesifikk modifisering. Proteinet av interesse i denne studien, SBDS, inneholder 5 gratis cysteiner og 33 lysines som kan resultere i flere språk merking. Ikke-uniform merking kan påvirke binding og vil komplisere dataanalyse som ulike fluoroformolekyler kan lokke fram ulike fluorescerende intensitet signaler ved binding. Overcome dette problemet, brukte vi Flash fluorophore, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein til nettstedet Direkt label SBDS protein. Dette er en arsenoxide fargestoff med en høy affinitet for fire adskilte cysteiner i et motiv kjent som flash-kode som består av sekvensen CCXXCC hvor X er hvilken som helst aminosyre annen enn cystein ^16,17. Dette tetracysteine ​​motiv tilsettes til N- eller C-terminale enden av proteinet ved hjelp av genteknologi sammen med en egnet linker for å forhindre forstyrrelse av den samlede fold av proteinet. Paret består av Flash fargestoff og Flash-koden ble opprinnelig utviklet for å stedsspesifikke label proteiner i levende celler ^17, men det kan også brukes til å merke rensede proteiner in vitro som det er eksemplifisert her. I tillegg har enzymatiske strategier også blitt utviklet for å muliggjøre stedsspesifikke funksjonalisering av proteiner ^18.

I dette manuskriptet beskriver vi nytten av fluorescens anisotropi enet verktøy for å studere protein-protein interaksjoner. Binding kan vurderes ved enkel inspeksjon av bindingen kurveformen mens kvantitativ informasjon kan fås fra tilpasning av de eksperimentelle data.

Protocol

1. SBDS-Blits tag Protein Expression og rensing MERK: For anisotropi eksperimenter, en flash-tag tilsvarende sekvensen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys ble satt til C-terminalen av de menneskelige SBDS kodende sekvens av PCR. Denne konstruksjonen ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren pRSET-A og transformert inn i Escherichia coli-C41-celler til å uttrykke et protein som koder for en N-terminal hexahistidine tag (His-tag), de humane SBDS kodende sekvens og en C-terminus flash-tag 10. <str…

Representative Results

For å utføre en hvilken som helst anisotropi eksperiment er det viktig å utelukke store endringer i fluorescensintensitet av fluoroforen siden den observerte anisotropi i en blanding av arter er representert ved ligning 5: hvor F i representerer den fraksjons fluorescens av hver …

Discussion

De fleste biokjemiske forsøk med proteiner krever ikke bare rent protein, men også store mengder av dem, uavhengig av hvilken teknikk som brukes. Av denne grunn er de proteinene som benyttes for denne type forsøk erholdt ved heterolog ekspresjon, slik det var tilfellet presentert her. Florescence spektroskopi krever tilstedeværelse av en fluorofor i den studerte molekylet. Aromatiske rester utgjør den iboende fluoroforene av et protein, men ved hjelp av sitt signal for å studere protein-protein interaksjoner kompl…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox