Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di studi sono diventati sempre più comuni nelle indagini di segnalazione GPCR. Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato un sensore intra-molecolare FRET per rilevare l'interazione tra subunità Gα e GPCR in cellule live che seguono la stimolazione agonista. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per rilevare i cambiamenti nella FRET tra il β 2 del recettore adrenergico ed il Gαs C-terminale del peptide in seguito al trattamento con 100 micron isoproterenolo cloridrato come precedentemente caratterizzati 1. Il nostro sensore FRET è un singolo polipeptide che consiste in serie di un GPCR full-length, un fluoroforo FRET accettore (mCitrine), un ER / K SPASM (sistematica di proteine affinità la forza di modulazione) linker, un fluoroforo FRET donatore (mCerulean), e un Gα C peptide -Terminal. Questo protocollo sarà la preparazione delle cellule dettaglio, le condizioni di trasfezione, installazione di apparecchiature, l'esecuzione del test, e analisi dei dati. Questo disegno sperimentale rileva piccolo changes in FRET indicativi di interazioni proteina-proteina, e può anche essere utilizzato per confrontare la forza di interazione tra ligandi e abbinamenti di proteine GPCR-G. Per migliorare il rapporto segnale-rumore nelle nostre misurazioni, questo protocollo richiede precisione accresciuto in tutte le fasi, ed è presentato qui per consentire l'esecuzione riproducibile.
Introduction
recettori G-proteina-accoppiati (GPCR) sono recettori sette transmembrana. Il genoma umano contiene solo circa 800 geni codificanti per GPCR, attivati da una varietà di ligandi compresi luce, odoranti, ormoni, peptidi, farmaci e altre piccole molecole. Quasi il 30% di tutti i farmaci attualmente sul GPCR bersaglio mercato perché svolgono un ruolo importante in molti stati di malattia 2. Nonostante decenni di intenso lavoro svolto su questa famiglia di recettori, rimangono significative questioni in sospeso in materia, in particolare per quanto riguarda i meccanismi molecolari che guidano le interazioni GPCR-effettrici. Ad oggi, solo una struttura cristallina ad alta risoluzione è stato pubblicato, permettono di approfondire l'interazione tra il recettore β 2 adrenergico (β 2 -AR) e la proteina Gs 3. Insieme alla vasta ricerca nel corso degli ultimi tre decenni, si ribadisce una specifica componente strutturale che è fondamentale in questointerazione: la subunità Gα C-terminale. Questa struttura è importante sia per l'attivazione della proteina G dalla selezione proteine GPCR 4 e G 5-6. Quindi, il Gα C-terminale fornisce un collegamento cruciale tra la stimolazione del ligando GPCR e l'attivazione della proteina G selettivo.
La ricerca negli ultimi dieci anni suggerisce che i GPCR popolano un vasto paesaggio conformazionale, con ligando vincolante stabilizzazione sottoinsiemi di conformazioni GPCR. Mentre sono disponibili per esaminare il paesaggio conformazionale GPCR diverse tecniche, tra cui la cristallografia, NMR e spettroscopia di fluorescenza, e spettrometria di massa, vi è una scarsità di approcci per spiegare il loro significato funzionale nella selezione effettore 7. Qui, descriviamo un Fӧrster trasferimento di energia di risonanza (FRET) approccio basata su per rilevare proteine G-selettivo conformazioni GPCR. FRET basa sulla prossimità e orientamento parallelo di due fluorofori con sovrapposizione di emissione (donatore) unND eccitazione (accettore) spettri 8. Come fluorofori donatore e accettore avvicinano insieme come risultato di una variazione conformazionale nella proteina o un'interazione proteina-proteina, il FRET tra loro aumenta, e può essere misurata usando una serie di metodi 8. Biosensori FRET-based sono stati impiegati ampiamente nel campo GPCR 9. Essi sono stati utilizzati per sondare cambiamenti conformazione del GPCR inserendo donatore e accettore nel terzo ciclo intracellulare e GPCR C-terminale; I sensori sono stati progettati per sondare GPCR e le interazioni effettrici etichettando separatamente i GPCR e effettrici (proteine G subunità / arrestine) con un paio FRET 10; alcuni sensori rilevano anche i cambiamenti conformazionali nella proteina G 11. Questi biosensori hanno permesso il campo per chiedere una moltitudine di questioni in sospeso, tra cui i cambiamenti conformazionali nella GPCR e effettori, cinetiche di interazione GPCR-effettrici e ligandi allosterici 12. Il nostro gruppoera particolarmente interessato a creare un biosensore in grado di rilevare G specifiche proteine conformazioni GPCR in condizioni di agonisti-driven. Questo biosensore si basa su una tecnologia sviluppata di recente nominato SPASM (sistematica di proteine affinità la forza di modulazione) 13. SPASM coinvolge tethering interagire domini proteici usando un / K linker ER, che controlla le loro concentrazioni efficaci. Accanto al linker con un paio FRET di fluorofori crea uno strumento che può segnalare lo stato dell'interazione tra proteine 12. In precedenza 1 il modulo SPASM è stato utilizzato per legare la Gα C-terminale di un GPCR e monitorare le loro interazioni con fluorofori FRET, mCitrine (di cui al presente protocollo da parte sua variante comunemente noto, giallo fluorescente delle proteine (YFP), di eccitazione / picco di emissione a 490/525 nm) e mCerulean (di cui al presente protocollo per la sua comunemente noto variante Cyan Fluorescent Protein (PCP), di eccitazione / picco di emissione 430/475 nm). Da N- al C-terminale, tla sua geneticamente codificato singolo polipeptide contiene: un full length GPCR, FRET accettore (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donatore (mCerulean / PCP), e il peptide Gα C-terminale. In questo studio, i sensori sono abbreviati come GPCR-linker lunghezza Gα peptide. Tutti i componenti sono separati da una non strutturato (Gly-Ser-Gly) 4 linker che permette la rotazione libera di ciascun dominio. La caratterizzazione dettagliata di tali sensori è stato precedentemente effettuata utilizzando due GPCR prototipo: β 2 -AR e opsin 1.
Questo sensore è transientemente trasfettato in cellule HEK-293T e fluorimetro basato vivo esperimenti cellulari misura spettri di fluorescenza della coppia FRET in unità arbitrarie di conteggi al secondo (CPS) in presenza o assenza di ligando. Queste misurazioni vengono utilizzati per calcolare un rapporto FRET tra i fluorofori (YFP max / CFP max). Un cambiamento di FRET (ΔFRET) viene calcolato sottraendo il rapporto medio FRETcampioni non trattati dal rapporto di FRET di campioni ligando trattati. ΔFRET può essere paragonato attraverso costrutti (β 2 -AR-10 nm-Gαs peptide contro beta2-AR-10 nm-no peptide). Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di esprimere questi sensori in cellule HEK-293T dal vivo, monitoriamo la loro espressione, e la messa a punto, l'esecuzione e l'analisi delle cellule vive fluorimetro a base Fret misura per non trattati rispetto a condizioni trattati con farmaci. Anche se questo protocollo è specifico per il sensore di peptide β 2 -AR-10 nm-Gαs trattati con 100 micron isoproterenolo bitartrato, può essere ottimizzato per diverse coppie GPCR-Gα e leganti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La gamma dinamica stretta di misurazioni FRET in questo sistema accentua la necessità di controllo di qualità sensibile in ogni fase di questo protocollo. I passi più importanti per assicurare un esperimento riuscito FRET sono 1) la coltura delle cellule, 2) trasfezione 3) l'espressione della proteina e 4) puntuale, preciso coordinamento durante l'esecuzione del test.
la salute delle cellule e la qualità di manutenzione / placcatura possono avere un impatto significativo sul rumo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUM è stato finanziato dalla Compagnia americano Heart Association Pre-dottorato (14PRE18560010). La ricerca è stata finanziata dalla American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) e NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105.646-01-A1) alla SS
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
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