ライブ細胞懸濁液の蛍光光度アッセイでFRETセンサーを用いて測定したGタンパク質選択的なGPCRの立体配座
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster共鳴エネルギー移動（FRET）の研究はGPCRシグナル伝達の研究においてますます一般的になっているベース。我々の研究グループは、アゴニスト刺激の後に生細胞にGαサブユニットとのGPCRとの相互作用を検出するために、分子内FRETセンサーを開発しました。ここでは、詳細以前に1を特徴とするβ2アドレナリン受容体および100μM塩酸イソプロテレノールで処理するとのGαsC末端ペプチドとの間のFRETの変化を検出するためのプロトコル。私たちのFRETセンサーは、全長GPCR、FRETアクセプターフルオロフォア（mCitrine）の直列からなる単一のポリペプチドである、ER / K SPASM（系統的なタンパク質親和性の強度変調）リンカ、FRETドナーフルオロフォア（mCerulean）、およびGαC末端ペプチド。このプロトコルは、詳細細胞調製物、トランスフェクション条件、機器の設定、分析の実行、およびデータ解析します。この実験設計は、小さなCHを検出し、アンジェFRETにおけるタンパク質 – タンパク質相互作用を示し、また、リガンドとGPCR-Gタンパク質のペアの両端の相互作用の強さを比較するために使用することができます。我々の測定の信号対雑音比を向上させるために、このプロトコルは、すべてのステップで高め精度を必要とし、再現可能な実行を可能にするためにここに提示されています。
Introduction
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、7回膜貫通型受容体です。ヒトゲノムだけでは、光、臭気物質、ホルモン、ペプチド、薬物および他の小分子を含む種々のリガンドによって活性化されたGPCRをコードする約800の遺伝子が含まれています。市場ターゲットのGPCRで現在のすべての医薬品の約30％は、彼らは多くの疾患状態2に大きな役割を果たしているため。この受容体ファミリーで行わ広範な仕事の何十年にもかかわらず、特にGPCR-エフェクターの相互作用を駆動する分子メカニズムに関して、フィールドで大幅な未解決の問題が残っています。現在までに、唯一の高解像度の結晶構造は、β2アドレナリン受容体（β2 -AR）およびGタンパク質3との間の相互作用への洞察を提供し、公開されています。一緒に過去30年間で大規模な調査では、この中で重要である一つの特定の構造コンポーネントを繰り返します相互作用：GαサブユニットのC末端。この構造は、GPCR 4及びGタンパク質選択5-6によって、Gタンパク質活性化の両方のために重要です。したがって、GαC末端は、GPCRのリガンド刺激と選択的Gタンパク質活性化の間の重要なリンクを提供します。
過去10年間の研究では、GPCRは、GPCRの立体配座のリガンド結合安定化のサブセットで、広範なコンフォメーションの風景を取り込むことを示唆しています。結晶学、NMRおよび蛍光分光法、および質量分析を含むいくつかの技術は、GPCRの立体配座風景を調べるために利用可能であるが、エフェクターの選択7での機能的意義を解明するアプローチの不足があります。ここでは、Gタンパク質の選択的GPCRコンフォメーションを検出するFӧrster共鳴エネルギー移動（FRET）ベースのアプローチを概説します。 FRETは、発光（ドナー）Aを重複して2つのフルオロフォアの近接性と平行な向きに依存していますND励起（アクセプター）スペクトル8。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアは、コンフォメーションのタンパク質の変化またはタンパク質-タンパク質相互作用のいずれかの結果として互いに近くに来るように、それらの間のFRETが増加し、方法8の範囲を使用して測定することができます。 FRETベースのバイオセンサーは、GPCRフィールド9で広く使用されています。これらは、第三の細胞内ループ、およびGPCRのC末端にドナーとアクセプターを挿入することによって、GPCRにおけるコンホメーション変化を調べるために使用されてきました。センサーは別々 FRET対10でGPCRおよびエフェクター（Gタンパク質サブユニット/アレスチン）を標識することにより、GPCRとエフェクターとの相互作用を調べるために設計されています。いくつかのセンサは、Gタンパク質11の立体構造変化を検出します。これらのバイオセンサーは、コンフォメーションGPCRの変化やエフェクター、GPCR-エフェクターの相互作用動態、およびアロステリックリガンド12を含む未解決の質問の多くを尋ねるために、フィールドを有効にしています。私たちのグループアゴニスト主導の条件の下でGタンパク質に特異的GPCRの立体構造を検出することができるバイオセンサーを作成する際に特に興味がありました。このバイオセンサーは、（系統的なタンパク質親和性の強度変調）13 SPASMという名前の最近開発された技術に依存しています。痙攣テザリングそれらの有効濃度を制御するER / Kのリンカーを用いて、タンパク質ドメインの相互作用を含みます。フルオロフォアのFRETペアを有するリンカーに隣接する蛋白質12との間の相互作用の状態を報告することができるツールを作成します。以前に1 SPASMモジュールはGPCRにGαC末端テザーとFRETフルオロフォアとの相互作用をモニターするために使用された、mCitrineは（その一般的に知られている変異体、黄色蛍光タンパク質（YFP）、励起/発光ピークにより、このプロトコルで言及します励起/発光ピーク475分の430 nm）を（その一般的に知られている変異体シアン蛍光タンパク質（CFPによりこのプロトコルで呼ばれる）525分の490 nm）をmCerulean。 N末端からC末端へ、T彼の遺伝的にコード化された単一のポリペプチドが含まれています：全長GPCRは、アクセプター（mCitrine / YFP）のFRET、10 nmのER / Kリンカ、FRETドナー（mCerulean / CFP）、およびGαC末端ペプチド。本研究では、センサは、GPCR-リンカー長-Gαペプチドと略記されています。すべてのコンポーネントは、各ドメインの自由な回転を可能にする非構造化（のGly-Serで-Glyを）4リンカーによって分離されています。このようなセンサの詳細な特徴は、以前に2原型のGPCRを用いて行った：2 -ARとオプシンβ1。
このセンサは、一過性リガンドの存在下または非存在下でのHEK-293T細胞毎秒カウントの任意の単位におけるFRETペアの蛍光ベースの生細胞実験測定蛍光スペクトル（CPS）にトランスフェクトします。これらの測定は、フルオロフォア（YFP 最大 / CFP 最大 ）の間のFRET比を計算するために使用されます。 FRETの変化（ΔFRET）を、平均FRET比を減算することによって計算されますリガンド処理されたサンプルのFRET比からの未処理のサンプル。 ΔFRETは（β2 -AR-10nmのペプチドなし対β2 -AR-10 NM-のGαsペプチド）の構築物間で比較することができます。ここでは、詳細、ライブHEK-293T細胞において、これらのセンサを表現し、その発現を監視し、設定、実行、および薬物処置条件に対する未処理のための蛍光ベースの生細胞のFRET測定の解析するためのプロトコル。このプロトコルは、100μMイソプロテレノール酒石酸水素で処理したβ2 -AR-10、NM-のGαsペプチドセンサに特異的であるが、異なるGPCR-Gαペアおよびリガンドのために最適化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このシステムにおけるFRET測定の緊密なダイナミックレンジは、このプロトコルのすべてのステップで敏感な品質管理の必要性を強調しています。成功したFRET実験を確保するために最も重要なステップは、アッセイの実行中に1）細胞培養、2）トランスフェクション3）タンパク質発現および4）タイムリー、正確なコーディネートです。
細胞の健康やメンテナンス/めっき?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUMは、米国心臓協会の事前の博士フェローシップ（14PRE18560010）によって賄われていました。研究は、米国心臓協会サイエンティスト開発グラント（13SDG14270009）＆SSにNIH（1DP2 CA186752-01＆1-R01-GM-105646から01-A1）によって賄われていました
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
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