G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) çalışmaları GPCR sinyalizasyon soruşturma giderek daha yaygın hale gelmiştir tabanlı. Araştırma grubumuz Gα alt birimlerinin ve agonist stimülasyon takip eden canlı hücrelerde GPCRs arasındaki etkileşimi tespit etmek için bir intra-moleküler FRET sensörü geliştirdi. Burada, ayrıntılı 100 uM izoproterenol hidroklorür ile işlenmesi üzerine β 2-adrenerjik reseptörü ve Gαs C-terminali peptid arasında FRET değişiklikleri tespit etmek için protokol daha önce 1 karakterize edilen. Bizim FRET sensörü, tam uzunlukta bir GPCR, FRET akseptör-floroforu (mCitrine) seri olarak aşağıdakilerden oluşan tek bir polipeptid olup, bir ER / K SPASM (sistematik proteinin afinite gücü modülasyonu) bağlayıcı olarak, bir FRET verici florofor (mCerulean) ve Gα Cı terminal peptid. Bu protokol olacak detay hücre hazırlama, transfeksiyon koşulları, ekipman kurulumu, tahlil yürütme ve veri analizi. Bu deney tasarımı, küçük ch algılarAnges'a FRET protein-protein etkileşimleri göstermektedir ve ayrıca ligandları ve GPCR G proteini eşleşmeleri arasında etkileşim gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir. sinyal-gürültü bizim ölçümlerde geliştirmek için, bu protokol her adımda artan hassasiyet gerektirir ve tekrarlanabilir yürütülmesini sağlamak için sunulmuştur.
Introduction
G-proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCR'ler) yedi transmembran reseptörlerdir. İnsan genomu tek ışık, koku, hormonlar, peptitler, ilaçlar ve diğer küçük moleküller de dahil olmak üzere, çeşitli ligandlı ile aktive olan GPCR, kodlayan yaklaşık 800 gen içermektedir. Piyasa hedef GPCRs şu anda tüm ilaçların yaklaşık% 30 birçok hastalık durumlarında 2 büyük bir rol oynamaktadır çünkü. Bu reseptör ailesinin üzerinde yapılan kapsamlı çalışmaların yıllardır rağmen, özellikle GPCR-efektör etkileşimleri sürücü moleküler mekanizmaları açısından, alanında önemli seçkin soruları orada kalır. Bugüne kadar, sadece bir yüksek çözünürlüklü kristal yapı β 2 adrenerjik reseptör (β 2-AR) ve Gs proteini 3 arasındaki etkileşim içgörü sağlayarak, yayımlandı. Birlikte son üç yıl içinde kapsamlı bir araştırma ile, bu çok önemlidir belirli bir yapısal bileşen yineledietkileşim: Gα alt birim C-terminali. Bu yapı, GPCR 4 G protein seçiminde 5-6 her iki G protein aktivasyonu için önemlidir. Bu nedenle, Gα C-terminali GPCR ligand uyarılması ve seçici G protein aktivasyonu arasındaki önemli bir bağlantı sağlar.
son on yılda Araştırma GPCR'ler GPCR yapılardan alt kümelerini stabilize ligand bağlama ile, geniş bir yapısal peyzaj doldurmak olduğunu göstermektedir. Kristalografisi, NMR ve floresan spektroskopisi, ve kütle spektrometresi dahil olmak üzere birçok teknik, GPCR yapısal peyzaj incelemek için mevcut iken, efektör seçimi 7 fonksiyonel önemini açıklamak için yaklaşımlar azdır. Burada, G protein seçici GPCR konformasyonlar tespit etmek için bir Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir yaklaşım özetlemektedir. FRET emisyon (donör) a örtüşen iki fluorophores yakınlığı ve paralel yönde dayanırve tahrik (akseptör) spektrumları 8. Verici ve alıcı floroforlar konformasyonel protein değişikliği veya bir protein-protein etkileşimini bir sonucu olarak daha yakın bir araya geldiğinde, bunlar arasında FRET arttırır ve yöntem 8 bir dizi kullanarak ölçülebilir. FRET tabanlı biyosensörler GPCR alanda 9 yaygın istihdam edilmiştir. Üçüncü hücre döngüsü ve GPCR Cı-terminalindeki verici ve alıcı ekleyerek GPCR konformasyon değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır; Sensör ayrı FRET çifti 10, GPCR ve efektör (G protein alt-birimleri / arrestins) etiketleyerek GPCR ve efektör etkileşimlerini incelemek için dizayn edilmiştir; Bazı sensörler ayrıca G-proteinine 11 yapısal değişiklikleri algılar. Bu biyosensörler yapısal GPCR değişiklikler ve efektör, GPCR-efektör etkileşim kinetik ve allosterik ligandlar 12 olmak üzere seçkin sorular çok sayıda sormak alanını sağlamıştır. Bizim grubumuzagonist odaklı koşullar altında G-protein spesifik GPCR konformasyonlar tespit olabilecek bir biyosensör oluştururken özellikle ilgi oldu. Bu biyosensör (sistematik protein afinite gücü modülasyon) 13 SPASM adında bir süre önce geliştirilen teknoloji dayanmaktadır. SPASM etkin konsantrasyonlarını kontrol eden bir ER / K linker kullanılarak bağlama etkileşimli protein alanları içerir. Fluorophores bir FRET çifti ile linker sınırdaş proteinler 12 arasındaki etkileşimin durumunu rapor bir araç oluşturur. Daha önce 1 SPASM modülü GPCR için Gα C-ucunu halata ve FRET fluorophores ile etkileşimlerini izlemek için kullanılan, mCitrine (onun bilinen varyant, Sarı Floresan Protein (YFP), uyarma / emisyon zirve de bu protokolde atıfta bulunulan , uyarma / emisyon zirve 430/475 nm) (onun yaygın olarak bilinen varyant Mavi Floresan Protein (OBP bu protokolde atıfta bulunulan) 490/525 nm) ve mCerulean. N- Cı-terminaline, tonun genetik olarak kodlanmış bir polipeptidi içerir: tam uzunlukta bir GPCR, Alıcı (mCitrine / YFP) FRET, 10 nm ER / K bağlayıcı, FRET verici (mCerulean / CFP) ve Gα C-terminali peptid. Bu çalışmada, sensörler GPCR-bağlayıcı uzunluğu Gα peptidi olarak kısaltılmıştır. Bütün bileşenler her bir alan serbest dönmesine olanak sağlayan bir yapısal olmayan (Gly-Ser-Gly) 4 bağlayıcı ile ayrılır. Sensörler ayrıntılı özellikleri daha önce iki prototipik GPCR'ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir: 2-Ar ve opsin 1 β.
Bu sensör geçici HEK-293T hücreleri ve varlığı ya da ligandın yokluğunda saniye (cps) başına keyfi birimler FRET çiftinin florimetre bazlı canlı hücre deneyleri ölçer floresans spektrumları transfekte edilir. Bu ölçümler fluorophores (YFP max / OBP en yüksek) arasında bir FRET oranını hesaplamak için kullanılır. FRET (ΔFRET) bir değişiklik daha sonra ortalama FRET oranının çıkarılmasıyla hesaplanırLigand muamele edilmiş numunelerin FRET oranından işlem görmemiş örnekler. ΔFRET (β 2-AR-10 nm-Gαs peptid 2-AR-10 nm-hayır peptid p olan karşı) yapıları arasında mukayese edilebilir. Burada, detay protokol, canlı HEK-293T hücrelerinde bu sensörleri ifade ifadesini izlemek ve florimetre tabanlı canlı hücrenin kurulumu, yürütme ve analiz ilaç tedavi koşulları karşısında işlenmemiş için ölçüm FRET için. Bu protokol, 100 uM izoproterenol bitartarat ile muamele β 2-AR-10 nm Gαs peptid sensör için özel olsa farklı GPCR Gα çiftleri ve ligandlar için optimize edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu sistemde FRET ölçümlerinin sıkı dinamik aralık Bu protokolün her aşamasında hassas kalite kontrol gerekliliğini güçlendirmektedir. Başarılı bir FRET deneyi sağlamak için en önemli adımlar tahlil yürütülmesi sırasında 1) hücre kültürü, 2) transfeksiyon 3) protein ekspresyon ve 4) zamanında, hassas koordinasyon vardır.
Hücre sağlık ve bakım / kaplama kalitesi imkansız FRET herhangi tutarlı bir değişiklik tespit yapabilirsiniz deneysel sistem ve kötü h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUM Amerikan Kalp Derneği Öncesi doktora bursu (14PRE18560010) tarafından finanse edildi. Araştırma Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Grant (13SDG14270009) & SS NIH (1DP2 CA186752-01 ve 1-R01-GM-105646-01-A1) tarafından finanse edildi
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors – added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
