G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
העברת אנרגית תהודת Fӧrster (סריג) מבוססת מחקרים הפכו נפוצים יותר ויותר בחקירת איתות GPCR. קבוצת המחקר שלנו יצרה חיישן סריג תוך מולקולרי כדי לזהות את האינטראקציה בין Gα יחידות משנה ו GPCRs בתאים חיים בעקבות גירוי אגוניסט. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול לאיתור שינויים סריג בין קולטן β 2 -adrenergic ואת פפטיד C הסופית- Gαs על טיפול עם 100 מיקרומטר hydrochloride isoproterenol כפי שאפיינו 1. חיישן הסריג שלנו הוא פוליפפטיד יחיד המורכב סדרה של GPCR באורך מלא, fluorophore acceptor סריג (mCitrine), גידול ER / K עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) מקשר, fluorophore התורם סריג (mCerulean), וכן Gα C פפטיד -terminal. פרוטוקול זה התקנת פרט תא יהיה בהכנה, תנאי transfection, ציוד, ביצוע assay, וניתוח נתונים. עיצוב ניסיוני זה מזהה ch הקטןAnges ב הסריג מעיד על אינטראקציות בין חלבונים, והוא יכול לשמש גם כדי להשוות את עוצמת האינטראקציה ברחבי הליגנדים ואת זיווגי חלבון GPCR-G. כדי לשפר את האות לרעש במדידות שלנו, פרוטוקול זה דורש דיוק מוגבר בכל השלבים, והוא מוצג כאן כדי לאפשר ביצוע לשחזור.
Introduction
G המצומדים קולטנים (GPCRs) הם קולטנים שבע הטרנסממברני. גנום האדם לבדו מכיל כ 800 גנים המקודדים GPCRs, אשר מופעלים על ידי מגוון של הליגנדים כולל אור, ניחוחי, הורמונים, פפטידים, תרופות ומולקולות קטנות אחרות. קרוב ל -30% מכלל התרופות כיום על GPCRs היעד בשוק משום שהם ממלאים תפקיד גדול מצבי מחלה רב 2. למרות עשרות שנים של עבודה מטה מקיפה נעשתה על מש' קולטן זה, נותר שאלות מצטיינות משמעותיות בתחום, במיוחד לגבי המנגנונים המולקולריים לנהוג אינטראקציות מפעיל GPCR. נכון להיום, רק המבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה אחד כבר פורסם, מתן תובנה אינטראקציה בין רצפטור β 2 -adrenergic (β 2 -AR) ואת חלבון G 3. יחד עם מחקר מקיף בשלושת העשורים האחרונים, זה חוזר על רכיב מבני ספציפי אחד כי הוא קריטי זהאינטראקציה: C- הסופי למקטע Gα. מבנה זה הוא חשוב עבור שתי הפעלת חלבון G על ידי מבחר חלבון GPCR 4 ו- G 5-6. לפיכך, הסופית- C Gα על זיקה מכרעת בין גירוי ליגנד של GPCR והפעלה G חלבון סלקטיבית.
מחקר בעשור האחרון מצביע על כך GPCRs לאכלס נוף קונפורמציה רחב, עם ייצוב תת-מחייב ליגנד של תצורות GPCR. בעוד מספר טכניקות, כוללים קריסטלוגרפיה, NMR ספקטרוסקופיה קרינה, ו ספקטרומטריית מסה זמינות לבחון את נוף קונפורמציה GPCR, יש מחסור של גישות להבהיר המשמעות התפקודית שלהם בבחירת מפעיל 7. הנה, הנה תיאור של העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (סריג), גישה מבוססת על לזהות תצורות GPCR חלבון-סלקטיבית G. סריג מסתמך על הקרב וכיוון במקביל של שני fluorophores עם פליטת חופפים (תורם) אnd עירור (acceptor) ספקטרה 8. ככל fluorophores התורם acceptor להתקרב יחד כתוצאה משני של שינוי קונפורמציה בחלבון או אינטראקציה חלבון-חלבון, סריג ביניהם גדל, והוא יכול להימדד באמצעות מגוון של שיטות 8. חיישנים ביולוגיים מבוסס סריג להיות מועסקים בהרחבה בתחום GPCR 9. הם שמשו לחקר שינויים קונפורמציה של GPCR ידי החדרת תורם acceptor בלולאה התאית השלישית GPCR C- הסופית; חיישנים עוצבו כדי לחקור GPCR ואינטראקציות מפעיל ידי בנפרד תיוג GPCR ו מפעיל (יחידות משנה חלבון G / arrestins) עם זוג סריג 10; חיישנים מסוימים גם לזהות שינויי קונפורמציה חלבון G 11. חיישנים ביולוגיים אלה אפשרו בתחום לשאול המון שאלות מצטיינים כולל שינויים קונפורמציה GPCR ו מפעיל, קינטיקה אינטראקציה GPCR-מפעיל, ו ligands האלוסטריים 12. הקבוצה שלנוהתעניין במיוחד ביצירת biosensor שיכול לזהות תצורות GPCR חלבון ספציפי G בתנאים מונחה אגוניסט. Biosensor זה מסתמך על טכנולוגיה שפותחה לאחרונה בשם עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) 13. עווית כרוכה תחומי חלבון אינטראקצית קשירה באמצעות מקשר ER / K, שולטת הריכוזית היעילה שלהם. איגוף ומקשר עם זוג fluorophores סריג יוצר כלי שיכול ולדווח על המצב של יחסי הגומלין בין חלבוני 12. בעבר 1 מודול התכווצות שימש לקשור את C- הסופית Gα על GPCR ולפקח הגומלין שלהם עם fluorophores סריג, mCitrine (המכונה בפרוטוקול זה על ידי גרסה שלה הידוע בכינויו, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), עירור / פליטה לשיא 490/525 ננומטר) mCerulean (המכונה בפרוטוקול זה על ידי חלבון ציאן פלורסנט וריאנט שלו הידוע בכינויו (CFP), עירור / פליטה השיא 430/475 ננומטר). מאת N- כדי C- סופי, tפוליפפטיד היחיד שלו המקודד גנטי מכיל: באורך מלא GPCR, סריג acceptor (mCitrine / YFP), 10 ננומטר ER / מקשר K, תורם סריג (mCerulean / CFP), ואת פפטיד הסופית- C Gα. במחקר זה, חיישנים מקוצרים כמו פפטיד GPCR המקשר אורך-Gα. כל הרכיבים מופרדים על ידי מקשר בלתי מובנה (גלאי-שיר-גלאי) 4 המאפשר סיבוב חופשי של כל תחום. האפיון המפורט של חיישנים כאלה בוצע בעבר בעזרת שתי GPCRs אבטיפוס: β 2 -AR ו opsin 1.
חיישן זה הוא transfected זמני לתאי HEK-293T, ספקטרום קרינת מידת ניסויי תא חי מבוסס fluorometer של זוג הסריג ביחידות כלשהן של ספירה לשנייה (CPS) בנוכחות או בהעדר ליגנד. מדידות אלה משמשים לחישוב יחס סריג בין fluorophores (YFP מקסימום / מקס CFP). שינוי סריג (ΔFRET) לאחר מכן מחושב על ידי הפחתת יחס סריג הממוצעשל דגימות מטופל מייחס הסריג של דגימות מטופלים ליגנד. ΔFRET ניתן להשוות ברחבי בונה (β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs פפטיד לעומת בטא 2 -AR-10 ננומטר-אף פפטיד). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול להביע חיישנים אלה בתאי HEK-293T חיים, לפקח הביטוי שלהם, ואת ההתקנה, ביצוע, והניתוח של התא החי מבוסס fluorometer סריג מדידת מטופל מול תנאי מטופלים בתרופה. בעוד פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור חיישן פפטיד β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs שטופלו 100 מיקרומטר bitartrate isoproterenol, זה יכול להיות מותאם במיוחד בזוגות הליגנדים GPCR-Gα שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטווח הדינמי החזק של מדידות סריג במערכת זו מחזק את הצורך של בקרת איכות רגישה בכל שלב של פרוטוקול זה. השלבים החשובים ביותר כדי להבטיח ניסוי סריג מוצלח הם 1) culturing תא, 2) transfection 3) ביטוי חלבון ו -4) בזמן, תיאום מדויק במהלך ביצוע assay.
Cell ברי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
רום מומן על ידי הקרן איגוד הלב האמריקני קדם דוקטורט (14PRE18560010). המחקר מומן על ידי מענק פיתוח American Heart Association המדען (13SDG14270009) & NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105,646-01-A1) ל SS
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors – added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
