G Protein-selektive GPCR conformations måles ved hjelp av FRET sensorer i en levende celle Suspension fluorometer analysen

Summary

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Abstract

Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -baserte studier har blitt stadig mer vanlig i etterforskningen av GPCR signalering. Vår forskningsgruppe utviklet en intra-molekylær FRET sensor for å oppdage samspillet mellom Gα underenheter og GPCRs i levende celler følgende agonist stimulering. Her har vi detalj protokollen for å detektere endringer i FRET mellom β _2-adrenerge reseptoren og Gas C-terminale peptid ved behandling med 100 uM isoproterenol-hydroklorid som tidligere karakteriserte ^1. Vår FRET sensor er et enkelt polypeptid bestående serie av en full-lengde GPCR, en FRET akseptor fluorofor (mCitrine), en ER / K krampe (systematisk protein affinitet styrke modulasjon) linker, en FRET donor fluorofor (mCerulean), og en Gα C terminale peptid. Denne protokollen vil detalj celle forberedelse, transfeksjon forhold, oppsett av utstyr, analyse gjennomføring og dataanalyse. Dette eksperimentell design oppdager små lmanges i FRET indikasjon på protein-protein interaksjoner, og kan også brukes til å sammenligne styrken av interaksjonen tvers av ligander og GPCR-G-protein paringer. For å forbedre signal-til-støy i våre målinger, krever denne protokollen økt presisjon i alle ledd, og er presentert her for å muliggjøre reproduserbar utførelse.

Introduction

G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er syv-transmembran-reseptorer. Det humane genom alene inneholder omtrent 800 gener som koder for GPCR, som aktiveres av en rekke ligander, inkludert lys, odoranter, hormoner, peptider, medikamenter og andre små molekyler. Nesten 30% av alle legemidler på markedet målet GPCRs fordi de spiller en stor rolle i mange sykdomstilstander ^2. Til tross for flere tiår med omfattende arbeidet som er gjort på denne reseptoren familie, er det fortsatt betydelige utestående spørsmål i feltet, spesielt med hensyn til de molekylære mekanismene som driver GPCR-effektor interaksjoner. Hittil har bare en høy oppløsning krystallstruktur blitt publisert, og gir innsikt i samspillet mellom β _2-adrenerge reseptor (β _2-AR) og Gs protein ^tre. Sammen med omfattende forskning i de siste tre tiårene, gjentar det en bestemt strukturell komponent som er avgjørende i denneinteraksjon: den Gα subenheten C-terminus. Denne strukturen er viktig både for G-protein aktivering av GPCR ⁴ og G-protein utvalg ^5-6. Følgelig tilveiebringer Gα C-terminus en viktig sammenheng mellom ligand stimulering av GPCR og selektiv G-protein aktivering.

Forskning det siste tiåret tyder på at GPCRs fylle en bred conformational landskap, med ligand-bindende stabiliserende undergrupper av GPCR konformasjoner. Mens flere teknikker, inkludert krystallografi, NMR-spektroskopi og fluorescens, og massespektrometri er tilgjengelige for å undersøke GPCR konformasjonell landskapet, er det en mangelen av tilnærminger for å belyse deres funksjonelle betydning i effektor utvalg ^7. Her skisserer vi en Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -basert tilnærming til å oppdage G protein-selektive GPCR konformasjoner. FRET er avhengig av nærheten og orienteringen av to parallelle fluoroforer med overlappende emisjon (donor) ennd eksitasjon (akseptor) spektra ^8. Som donor og akseptor fluoroforer komme nærmere hverandre som et resultat av enten konformasjonell forandring i protein eller et protein-protein interaksjon, den FRET mellom dem øker, og kan måles ved hjelp av en rekke metoder ^8. FRET-basert biosensorer har vært ansatt i stor utstrekning i GPCR felt ^9. De har blitt anvendt for å probe conformation forandringer i GPCR ved innføring av donor og akseptor i den tredje intracellulære løkke og GPCR C-terminale ende; sensorer har blitt designet for å undersøke GPCR og effektor interaksjoner med separat merking av GPCR og effektor (G protein subenheter / arrestins) med en FRET par ^10; enkelte sensorer også detektere konformasjonsendringer i G-proteinet ^11. Disse biosensorer har aktivert feltet for å spørre en rekke utestående spørsmål inkludert konformasjonsforandringer endringer i GPCR og effektor, GPCR-effektor interaksjonskinetikk og allosteriske ligander ^12. vår gruppevar spesielt interessert i å skape en biosensor som kan oppdage G protein-spesifikke GPCR conformations etter agonist-drevet forhold. Dette biosensor er avhengig av en nylig utviklet teknologi kalt krampe (systematisk protein affinitet styrke modulation) ^13. Krampe innebærer tethering samspill proteindomener som bruker en ER / K linker, som styrer deres effektive konsentrasjoner. Flankerer linker med en FRET par fluorophores skaper et verktøy som kan rapportere tilstanden av samspillet mellom proteiner ^12. Tidligere ^en krampe modulen ble brukt til å tjore Gα C-terminalen til en GPCR og overvåke deres interaksjon med FRET fluoroforer, mCitrine (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant, gul fluoriserende protein (YFP), eksitasjon / emisjon topp på 490/525 nm) og mCerulean (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant Cyan Fluorescent Protein (CFP), eksitasjon / emisjonstopp 430/475 nm). Fra N- til C-terminus, thans genetisk kodede enkelt polypeptid inneholder: en full lengde GPCR, FRET-akseptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donor (mCerulean / CFP), og den Gα C-terminale peptid. I denne studien, er følere forkortet som GPCR-linker lengde-Gα peptid. Alle komponentene er separert med et ustrukturert (Gly-Ser-Gly) _4-linkeren som muliggjør fri rotasjon av hvert domene. Den detaljerte karakteriseringen av slike sensorer er tidligere utført ved hjelp av to prototypiske GPCR: β _2-AR og opsin ^1.

Denne sensoren er transient transfektert inn i HEK-293T-celler og fluorometer-basert live celleforsøk måler fluorescens-spektrene for de FRET paret i vilkårlige enheter av tellinger pr sekund (CPS) i nærvær eller fravær av ligand. Disse målingene brukes til å beregne en FRET forholdet mellom fluorophores (YFP _max / CFP _max). En endring i FRET (ΔFRET) blir deretter beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige FRET forholdetav ubehandlede prøver fra FRET mellom ligand behandlede prøver. ΔFRET kan sammenlignes på tvers av konstruksjoner (β _2-AR-10 nm-Gas peptid versus beta _2-AR-10 nm-no peptid). Her har vi detalj protokollen for å uttrykke disse sensorene i levende HEK-293T celler, overvåke deres uttrykk, og oppsettet, gjennomføring og analyse av fluorometer-basert live celle FRET måling for ubehandlet versus legemiddelbehandlede forhold. Selv om denne protokollen er spesifikk for den β _2-AR-10 nm-Gas peptid sensor behandlet med 100 uM isoproterenol bitartrat, kan det være optimalisert for forskjellige GPCR-Gα par og ligander.

Protocol

1. DNA Forberedelse Design sensor konstruerer ved hjelp av en modulær kloning ordningen. Vennligst referere til β 2-AR sensordesign detaljert tidligere en. Fremstille DNA ifølge kommersielt miniprep settprotokollen og elueres i 2 mM Tris-HCl-løsning, pH 8, ved konsentrasjon ≥ 750 ng / ul, A 260 / A 280 fra 01/07 til 01/09, A 260 / A 230 fra 2,0 til 2,29. 2. Cell Culture Forberedelse …

Representative Results

En generalisert skjematisk av eksperimentet satt opp og gjennomføring er beskrevet i figur 3. For å oppdage en FRET endring i den smale dynamiske området av sensoren, er det viktig å følge nyansene av systemet følges. Celle kvalitet er viktig å proteinekspresjon samt konsistens i prøvetakings. Figur 1 trekk bilder av dyrkede celler som vokser i et konsistent monolag (10X) som er optimal for en seks-brønners platekledning og transfeksjon figu…

Discussion

Den tette dynamisk område på FRET målinger i dette systemet forsterker behovet for følsomme kvalitetskontroll i hvert trinn av denne protokollen. De viktigste tiltak for å sikre en vellykket FRET eksperiment er 1) celledyrking, 2) transfeksjon 3) protein uttrykk og 4) rettidig, nøyaktig koordinering under analysen utførelse.

Cell helse og vedlikehold / plating kvalitet kan ha en betydelig innvirkning på signal-til-støy av den eksperimentelle systemet og dårlig celle helse kan gjør…

Materials

B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells	Life Technologies	R78007
Trypsin (0.25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- high glucose	Life Technologies	11960-044	Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduced serum media; Bring to room temperature before use
XtremeGene HP transfection reagenet	Roche	6366236001	Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use
FluoroMax 4	Horiba		Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump	Fisher Scientific	13-874-826	Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water	Life Technologies	10977015	Use at room temperature
D(+)-glucose, anhydrous	Sigma	G5767
aprotinin from bovine lung	Sigma	A1153
leupeptin hemisulfate	EMD	10-897
L-ascorbic acid, reagent grade	Sigma	A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate	Sigma	I2760	Use fresh aliquot each experiment