אנו מתארים שיטה שונה לבידוד שבריר קרום מתאי אדם הכנת מדגם לצורך זיהוי של -glycosylation SCAP N ו- חלבון הכולל באמצעות כתם מערבי. בנוסף, אנו מציגים שיטה GFP תיוג לפקח סחר SCAP באמצעות מיקרוסקופ confocal. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדות ביולוגיה קבועות.
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
דה-רגולציה של מטבוליזם שומנים הוא מאפיין נפוץ של מחלות הסרטן ומטבוליות 1-6. בתהליכים אלו, חלבונים קושרי אלמנט מווסת sterol (SREBPs), משפחה של גורמי שעתוק, לשחק תפקיד קריטי שליטה על הביטוי של גנים חשובים עבור ספיגת וסינתזה של כולסטרול, חומצות שומן, פוספוליפידים 7-10.
SREBPs, כולל-1a SREBP, SREBP-1c, ו SREBP-2, מסונתזים כמו מבשרי פעיל אשר נקלטות על ידי reticulum endoplasmic (ER) קרום מכוח שני תחומים הטרנסממברני 7. N-הסופי של SREBPs מכיל תחום ה- DNA מחייבת עבור transactivation של גני המטרה 11. C- הסופית של מבשרי SREBP נקשר חלבון הפעלת מחשוף SREBP (SCAP) 12,13, חלבון הממברנה polytopic זה ממלא תפקיד חיוני בהסדרת יציבות SREBP והפעלה 14-16.
implemenשינוע של פונקציה תעתיק דורש טרנסלוקציה של המתחם SCAP / SREBP מ ER אל Golgi, שבו שני פרוטאזות ברצף לבקע SREBP ולשחרר שבר N- מסוף שלה, אשר לאחר מכן נכנס לתוך הגרעין עבור transactivation של גנים lipogenic 7. בתהליכים אלו, רמות של סטרולים בממברנה ER לשלוט היציאה של המתחם SCAP / SREBP מ ER 7,17. בתנאים sterol גבוהה, sterol נקשר SCAP או ER-תושב-induced אינסולין הגן חלבון-1 (Insig-1) או -2 (Insig-2), שיפור איגוד SCAP עם Insigs כי לשמר את מורכבות SCAP / SREBP ב ER 18-20. כאשר רמות sterol להקטין, SCAP מנתק עם Insigs. זה מוביל לשינוי קונפורמציה SCAP, המאפשר אינטראקציה SCAP עם חלבונים המעיל משותף (COP) מורכב השנייה. המתחם מתווכת שילוב של המתחם SCAP / SREBP לתוך שלפוחית ניצני ומפנה והובלתו מ ER אל Golgi 21,22. עם translocation אל Golgi, SREBPs הם ביקע ברצף ידי אתר-1 ו אתר-2 פרוטאזות, שמוביל את שחרורו של N הסופית- 7,23-29.
חלבון SCAP נושאת שלוש N -linked אוליגוסכרידים ב asparagine (N) ממקם N263, N590, N641 ו 15. אנו חשפנו לאחרונה כי בתיווך גלוקוז N -glycosylation של SCAP באתרים אלה הוא תנאי מוקדם לסחר SCAP / SREBP מ ER אל Golgi בתנאי sterol נמוכים 30-32. הפסד של glycosylation SCAP באמצעות מוטציה של כל שלושת asparagine כדי גלוטמין (NNN ל QQQ) משבית את הסחר של המתחם SCAP / SREBP ותוצאות חוסר היציבות של החלבון SCAP והפחתת SREBP הפעלה 31. הנתונים האחרונים שלנו הוכיחו SREBP-1 מופעלת מאוד גליובלסטומה והוא מווסת על ידי SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. מיקוד איתות SCAP / SREBP-1 מתגלה כאסטרטגיה חדשה לטיפול בממאירויות ו- s מטבוליתyndromes 1,3,35-38. לכן, חשוב לפתח שיטה יעילה לנתח את חלבון SCAP ו- N -glycosylation הרמות ולפקח הסחר שלה בתאים אנושיים ורקמות חולות.
האזור luminal של חלבון SCAP (חומצות אמינו 540-707) בחדר המיון מכיל שני אתרים -glycosylation N (N590 ו- N641) כי מוגנים מפני proteolysis כאשר קרומים שלמים מטופלים עם טריפסין 15. יש שבר לומינל זה משקל מולקולרי של ~ 30 kDa כי הוא קטן מספיק כדי לאפשר את הרזולוציה של וריאנטים glycosylated הפרט של SCAP ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) 15,31. כאן, אנו מספקים שיטה לגילוי N -glycosylation של SCAP ואת החלבון הכולל בתאים אנושיים. פרוטוקול זה נגזר השיטה המתוארת בפרסומים ממעבדת בראון וגולדשטיין 15 והפרסום האחרון שלנו 31. הפרוטוקול ניתן להשתמש tהוא ללמוד חלבון SCAP מתאי יונקים.
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור הבידוד של שברי קרום בתאים אנושיים וכן הם אחראים לעריכה של הדגימות לצורך זיהוי של -glycosylation SCAP N ו- חלבון הכולל באמצעות כתם מערבי. בנוסף, אנו מספקים שיטה לפקח סחר SCAP באמצעות GFP-תיוג מיקרוסקופיה confocal. השיטה משמשת במיוחד כדי לנתח את חל?…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
trypsin | Sigma | T6567 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
PNGase F | Sigma | P7367 | |
Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
pepstatin A | Sigma | P5318 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
DTT | Sigma | 43819 | |
ALLN | Sigma | A6185 | |
Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
glycerol | Sigma | G5516 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |