Analisi di SCAP<em> N</em> -glycosylation E il traffico nelle cellule umane
Summary
Descriviamo un metodo modificato per l'isolamento frazione di membrana da cellule umane e preparazione del campione per la rilevazione di -glycosylation SCAP N e proteine totali mediante western blot. Introduciamo inoltre un metodo GFP-etichettatura per monitorare il traffico di SCAP usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratori di biologia regolare.
Abstract
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Introduction
La deregolamentazione del metabolismo dei lipidi è una caratteristica comune di cancro e metaboliche malattie 1-6. In questi processi, steroli normativi proteine elemento vincolante (SREBPs), una famiglia di fattori di trascrizione, giocano un ruolo critico nel controllo della espressione di geni importanti per l'assorbimento e la sintesi del colesterolo, acidi grassi e fosfolipidi 7-10.
SREBPs, tra cui SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2, sono sintetizzate come precursori inattivi che si legano alla membrana del reticolo endoplasmatico (ER) in virtù di due domini transmembrana 7. L'N-terminale di SREBPs contiene un dominio di legame al DNA per la transattivazione di geni bersaglio 11. Il C-terminale di precursori SREBP lega al SREBP scissione-attivando proteina (SCAP) 12,13, una proteina di membrana politopica che gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della stabilità SREBP e l'attivazione 14-16.
all'attuazione della funzione trascrizionale richiede la traslocazione del complesso SCAP / SREBP dal pronto soccorso al Golgi, dove due proteasi in sequenza fendono SREBP e rilasciare il suo frammento N-terminale, che entra poi nel nucleo per la transattivazione di geni lipogenici 7. In questi processi, i livelli di steroli nella membrana ER controllano l'uscita del complesso SCAP / SREBP dal ER 7,17. In condizioni di elevate steroli, steroli lega alla SCAP o ER-residente insulino-indotta gene della proteina-1 (Insig-1) o -2 (Insig-2), migliorando l'associazione di SCAP con Insigs che mantengono il complesso SCAP / SREBP nel ER 18-20. Quando i livelli di steroli diminuiscono, SCAP dissocia con Insigs. Questo porta ad un cambiamento conformazionale SCAP, che consente l'interazione con proteine di rivestimento SCAP comuni complesso (COP) II. Il complesso media l'inserimento del complesso SCAP / SREBP nelle vescicole erba e dirige il suo trasporto dal pronto soccorso al Golgi 21,22. Su Transloczione al Golgi, SREBPs vengono sequenzialmente scissi mediante Site-1 e Site-2 proteasi, porta al rilascio del N-terminale 7,23-29.
Proteine SCAP trasporta tre N -linked oligosaccaridi a asparagina (N) posiziona N263, N590, N641 e 15. Abbiamo recentemente rivelato che il glucosio-mediata N -glycosylation di SCAP in questi siti è un prerequisito per il traffico di SCAP / SREBP dal pronto soccorso al Golgi in condizioni di bassa steroli 30-32. Perdita di SCAP glicosilazione tramite mutazione di tutti e tre asparagina a glutammina (NNN a qqq) disabilita il traffico del complesso SCAP / SREBP e risultati nella instabilità della proteina SCAP e la riduzione dell'attivazione SREBP 31. I nostri dati recenti dimostrano inoltre che SREBP-1 è altamente attiva nel glioblastoma e regolamentata dalla SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1 segnalazione sta emergendo come una nuova strategia per il trattamento di tumori maligni e s metaboliciyndromes 1,3,35-38. Pertanto, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare i livelli di proteina SCAP e N -glycosylation e controllare tale traffico di cellule umane e tessuti del paziente.
La regione luminale di proteine SCAP (aminoacidi 540-707) in un pronto soccorso contiene due siti -glycosylation N (N590 e N641) che sono protetti da proteolisi quando membrane intatte sono trattati con tripsina 15. Questo frammento luminale ha un peso molecolare di ~ 30 kDa che è abbastanza piccolo da consentire la risoluzione delle singole varianti glicosilate SCAP da sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) 15,31. Qui, forniamo un metodo per rilevare N -glycosylation della SCAP e proteine totali nelle cellule umane. Questo protocollo è derivato dal metodo descritto nelle pubblicazioni dal laboratorio Brown e Goldstein 15 e la nostra recente pubblicazione 31. Il protocollo può essere utilizzato in tegli lo studio di proteine SCAP da cellule di mammifero.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, si descrive un protocollo per l'isolamento di frazioni di membrana in cellule umane e per la preparazione dei campioni per l'individuazione di -glycosylation SCAP N e proteine totali mediante western blot. Forniamo inoltre un metodo per monitorare il traffico di SCAP utilizzando GFP-etichettatura e la microscopia confocale. Il metodo è specifico per analizzare proteina di membrana ed è uno strumento importante per indagare SCAP N -glycosylation e il traffico.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
Materials
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |
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