Summary

Scap analizi<em> K</em> İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Published: November 08, 2016
doi:

Summary

Bu Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için insan hücrelerinden membran fraksiyonu izolasyonu ve numune hazırlama yönelik değişik bir metot tarif etmektedir. Biz daha konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP ticaretini izlemek için bir GFP-etiketleme yöntemi tanıtmak. Bu protokol, normal bir biyolojik laboratuvarlarda kullanılabilir.

Abstract

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Introduction

Lipid metabolizması deregülasyon kanseri ve metabolizma hastalıkları 1-6 ortak bir özelliğidir. Bu işlemlerde, sterol düzenleyici elementi bağlayan proteinler (SREBPs), transkripsiyon faktörleri ailesidir, alım ve kolesterol, yağlı asitlerin sentezi ve fosfolipid 7-10 önemli genlerin ekspresyonunu kontrol etmede çok önemli bir rol oynar.

SREBP-1 a, SREBP-1 c ve SREBP-2 de dahil olmak üzere SREBPs, iki transmembran 7 sayesinde endoplazmik retikulum (ER) zarına bağlanan etkin olmayan öncüler olarak sentezlenir. SREBPs N-terminali, hedef genlerinin 11 transaktivasyonu için bir DNA-bağlama alanını içerir. SREBP öncülerinin C-terminali SREBP bölünmesi aktive edici protein (SCAP) 12,13, SREBP stabilitesi ve aktivasyon 14-16 düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynayan bir politopik membran proteinine bağlanır.

implementranskripsiyonel fonksiyonunun yon iki proteazlar ardışık SREBP ayrılması ve daha sonra lipojenik genlerin 7 transaktivasyonu için çekirdeğin içine girer N-terminal fragmanı serbest Golgi, ER SCAP / SREBP kompleksinin, gerektirir. Bu işlemlerde, ER membran sterol seviyeleri ER 7,17 den SCAP / SREBP kompleksinin çıkış kontrol eder. Yüksek sterol koşullar altında, sterol Scap veya ER yerleşik bağlanan insülin ile uyarılan gen proteini-1 (INSIG-1) veya 2 (INSIG-2), içinde SCAP / SREBP kompleksi korumak Insigs ile Scap ilişkisini arttırıcı ER 18-20. sterol düzeyleri azalma olduğunda, SCAP Insigs ile ayrışmaktadır. Bu ortak kaplama proteinleri (COP) II kompleksi ile SCAP etkileşim sağlayan bir SCAP konformasyonel değişime yol açar. Karmaşık tomurcuklanma vezikülleri içine SCAP / SREBP kompleksi dahil edilmesine aracılık eder ve Golgi 21,22 ER; nakliye yönlendirir. TRANSLOC üzerineGolgi ation, SREBPs ardışık N-terminali 7,23-29 serbest kalmasına yol, alana, 1 ve-2 proteaz tarafından ayrılmaktadır.

SCAP proteini N asparajinde oligosakkaritler -bağlı üç taşır (N) N263, N590, N641 ve 15 konumlandırır. Biz son zamanlarda bu sitelerde SCAP glukoz aracılı N -glycosylation düşük sterol koşullarında 30-32 altında Golgi ER SCAP / SREBP kaçakçılığı için bir ön koşul olduğunu ortaya koymuştur. (NNN qqq için) glutamin için üç asparagin mutasyon yoluyla SCAP glikosilasyon kaybı SCAP protein ve SREBP aktivasyon 31 azaltılması istikrarsızlık SCAP / SREBP kompleksinin ve sonuçların ticaretini devre dışı bırakır. Bizim son veriler de bu SREBP-1 yüksek glioblastoma aktive ve SCAP N -glycosylation 4,31,33,34 tarafından düzenlenir göstermektedir. Hedefleme SCAP / SREBP-1 sinyal maligniteler ve metabolik s tedavisinde yeni bir strateji olarak ortaya çıkmaktadır1,3,35-38 yndromes. Bu nedenle, SCAP proteini ve N -glycosylation düzeylerini analiz etmek ve insan hücreleri ve hasta dokularda kaçakçılığı izlemek için etkin bir yöntem geliştirmektir önemlidir.

ER 'in içinde SCAP proteini (amino asitler 540-707) luminal bölgesi sağlam zarları tripsin 15 ile muamele edildiğinde proteoliz korunur iki N -glycosylation sitesi (N590 ve N641) içerir. Bu lümen parçası, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 15,31 ile Scap bireysel glikosile varyantlarının çözünürlüğünü sağlamak için yeterince küçüktür ~ 30 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir. Burada, N Scap arasında -glycosylation ve insan toplam hücre proteini tespit etmek için bir yöntem sağlar. Bu protokol, Brown ve Goldstein, laboratuarda 15 ve son yayın 31 'den yayınlarda açıklanan yönteme elde edilir. Protokol t kullanılabilirO memeli hücrelerinden SCAP protein çalışma.

Protocol

İnsan hücrelerinde 1. Tespit endojen SCAP Protein Hücre Kültürü ve İşlem Tohum yaklaşık 1 x 10 6 U87% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 10 cm'lik bir tabak hücreleri ve tedaviden önce 24 saat boyunca CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5. fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez hücreler yıkanır, daha sonra 12 saat boyunca (5 mM) ile birlikte ya da glükoz ihtiva etmeyen taze …

Representative Results

Şekil 1, Western blot Glükoz uyarısına karşı tepki olarak insan glioblastoma U87 hücrelerinde endojen SCAP protein ve SREBP-1 nükleer formunun belirlenmesini göstermektedir. zar proteini SCAP "zar fraksiyonu" tespit edilir. SREBP-1 çekirdeği bir şekilde (N-terminal) "Nükleer özler" tespit edilir. SCAP protein düzeyi belirgin glükoz uyarılması ile geliştirilmiş ve SREBP-1 nükleer formu (KAE bir ER membran proteinlerinin iç k…

Discussion

Bu çalışmada, insan hücrelerinde membran fraksiyonlarının izolasyonu için ve Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için numune hazırlanması için bir protokol açıklar. Biz daha GFP-etiketleme ve konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP kaçakçılığı izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem özellikle membran proteini analiz etmek için kullanılan ve SCAP N -glycosylation ve insan ticaretini soruşturma önemli bir araçtır.

<p class="jove_content"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.

Materials

X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent  Roche 6366236001
Opti-MEMI medium  Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22G x 1 1/2 needle  BD  305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml  VWR 82023-102 
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi life technologies P36935
L-glutamine (200 mM) life technologies 25030081
sodium pyruvate life technologies 11360-070

References

  1. Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
  2. Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
  3. Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
  4. Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
  5. Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
  6. Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
  7. Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
  8. Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
  9. Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
  10. Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
  11. Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
  12. Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
  13. Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
  14. Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
  15. Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
  16. Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
  17. Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
  18. Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
  19. Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
  20. Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
  21. Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
  22. Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
  23. Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
  24. Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
  25. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
  26. Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
  27. Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
  28. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
  29. Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
  30. Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
  31. Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
  32. Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
  33. Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
  34. Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
  35. Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
  36. Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
  37. Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
  38. Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
  39. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  40. Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
  41. Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
  42. Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).

Play Video

Cite This Article
Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

View Video