Fabricating UV-Vis et Raman Spectroscopy Platform Immunoassay
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Les dosages immunologiques sont utilisés pour détecter des protéines sur la base de la présence d'anticorps associés. En raison de leur utilisation intensive dans la recherche et les paramètres cliniques, une grande infrastructure d'instruments et de matériaux immunoessais peut être trouvé. Par exemple, 96- et 384 puits de plaques de polystyrène sont disponibles dans le commerce et ont un design standard pour accueillir l'ultraviolet visible (UV-Vis) Machines de spectroscopie de différents fabricants. En outre, une grande variété d'immunoglobulines, des étiquettes de détection, et des agents de blocage pour la conception des dosages immunologiques personnalisés tels que des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) sont disponibles.
En dépit de l'infrastructure existante, des kits ELISA standards ne répondent pas à tous les besoins de la recherche, ce qui nécessite le développement d'immuno-essai individualisé, qui peut être coûteux et fastidieux. Par exemple, les kits ELISA ont une faible multiplexage (détection de plus d'un analyte à la fois) des capacités car elles dépendent généralement de la fluorescence ou de la colméthodes orimetric pour la détection. Des analyses colorimétriques et fluorescents à base ont des capacités limitées de multiplexage en raison de larges pics spectraux. En revanche, la spectroscopie Raman méthodes basées sur-ont une capacité beaucoup plus grande pour le multiplexage en raison des pics d'émission étroites. Un autre avantage de la spectroscopie Raman est que les journalistes Raman éprouvent beaucoup moins photoblanchiment que des marqueurs fluorescents 1. Malgré les avantages que les journalistes Raman ont plus de marqueurs fluorescents et colorimétriques, les protocoles pour fabriquer des immunoessais à base de Raman sont limitées. Le but de ce document est de fournir un protocole pour préparer des sondes fonctionnalisés à utiliser en conjonction avec des plaques de polystyrène pour la détection directe des analytes par analyse UV-Vis et spectroscopie Raman. Ce protocole permettra aux chercheurs d'adopter une approche do-it-yourself pour la détection future multi-analyte tout en capitalisant sur l'infrastructure pré-établie.
Introduction
dosages immunologiques en sandwich typique détecter indirectement la présence d'un antigène en utilisant deux anticorps. L'anticorps de capture est lié à une surface solide et forme un complexe anticorps-antigène lorsqu'il est à proximité d'un antigène approprié. Un anticorps de détection est ensuite introduit et se lie à l'antigène. Après lavage, les anticorps / antigène / anticorps et reste complexe est détecté par l'anticorps de détection marqué comme le montre la figure 1A. Détection typique est effectuée par un détecteur fluorescent ou colorimétrique, ce qui limite le multiplexage à 10 analytes en raison des larges pics spectraux 2,3. En revanche, les systèmes basés sur Raman ont des pics d'émission beaucoup plus étroite aboutissant à de meilleures capacités de multiplexage avec des sources revendiquant la détection simultanée de jusqu'à 100 analytes 2,3.
De nombreuses sources sont disponibles dans la littérature , qui couvrent des aspects importants liés à des dosages immunologiques 4 – 6 tel que l' étape par étape ,détails pour créer des kits ELISA personnalisés. Malheureusement, ces protocoles pour la détection fluorescente ou colorimétrique, ce qui limite la capacité de multiplexage des analyses immunologiques sur mesure. Pour répondre à ce besoin, nous présentons une procédure détaillée pour fabriquer les UV-Vis / Raman immunologique publié précédemment 7 pour une analyse immunologique directe comme illustré sur la figure 1B.
Ce protocole comprend la fabrication des sondes à base de nanoparticules d' or fonctionnalisée, représentée sur la figure 2. La procédure pour rendre les sondes / UV-Vis Raman commence par la presse Raman se lier à la surface des nanoparticules d'or (AuNPs). Les AuNPs sont ensuite fonctionnalisés avec des anticorps qui sont associés à du polyéthylène glycol (PEG). les sites de liaison restants sur les AuNPs sont bloquées par une liaison thiol, un groupe méthoxy polyéthylène glycol (mPEG-SH) afin d'empêcher AuNPs ultérieur liaison non spécifique au cours de l'analyse. Les sondes AUNP préparées sont testées en se liant à des antigènesfixé sur les puits d'une plaque de polystyrène comme illustré sur la figure 1B. Après lavage de la plaque, les sondes de AUNP sont détectés en utilisant la spectroscopie UV-visible, tandis que les reporters de Raman associés sont détectés par spectroscopie Raman. La combinaison des données Raman spectrale UV-Vis et fournit deux méthodes d'analyses, le renforcement des capacités de ce test immunologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le protocole détaillé, il existe plusieurs points critiques pour faire face. Une question est le choix de Raman reporter et nanoparticules d'or. Bien que le protocole a été écrit pour être adapté à un usage individuel, Raman journaliste DCTC a été utilisé comme un exemple. DCTC est un journaliste chargé positivement et se lie à des surfaces telles que le citrate plafonné AuNPs chargé négativement. Ce protocole peut être adapté pour les journalistes chargés négativement en utilisant des nanop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
