Herstellung eines UV-Vis und Raman-Spektroskopie Immunoassay-Plattform
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immunoassays werden verwendet, um Proteine zu detektieren basierend auf dem Vorhandensein von assoziierten Antikörpern. Aufgrund ihrer umfangreichen Einsatz in Forschung und klinischen Umgebungen kann eine große Infrastruktur von Immunoassay Instrumenten und Materialien zu finden. Beispielsweise 96- und 384-Well-Polystyrol-Platten sind kommerziell erhältlich und haben eine Standard-Design-ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie Maschinen verschiedener Hersteller aufzunehmen. Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Immunglobulinen, Nachweis-Tags, und Blockierungsmittel für individuelle Immunoassay Designs wie enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zur Verfügung.
Trotz der bestehenden Infrastruktur, Standard-ELISA-Kits erfüllen nicht alle Forschungsbedarf und erfordert individualisierte Immunoassay-Entwicklung, die teuer und zeitaufwendig sein kann. Zum Beispiel haben ELISA-Kits niedriger Multiplexen (Nachweis von mehr als einem Analyten in einer Zeit) -Funktionen, wie sie üblicherweise auf Fluoreszenz oder col hängenorimetric Methoden für die Erkennung. Kolorimetrische und fluoreszenzbasierte Analysen haben Multiplexierungsfähigkeiten aufgrund breiten spektralen Spitzen begrenzt. Im Gegensatz dazu ist die Raman-Spektroskopie-basierte Methoden haben eine viel größere Fähigkeit zum Multiplexen aufgrund enger Emissionsspitzen. Ein weiterer Vorteil der Raman – Spektroskopie ist , dass Raman – Reporter erfahren deutlich weniger Photobleichens als Fluoreszenzmarkierungen 1. Trotz der Vorteile, die Raman-Reporter haben über fluoreszierende und kolorimetrische Tags, um Protokolle herzustellen Raman-basierte Immunoassays begrenzt sind. Der Zweck dieser Arbeit ist es, ein Protokoll zu schaffen, funktionalisierte Sonden herzustellen in Verbindung mit Polystyrol-Platten für den direkten Nachweis von Analyten durch UV-Vis-Analyse und Raman-Spektroskopie verwendet werden. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, für die zukünftige Multi-Analyt-Detektion ein Do-it-yourself-Ansatz zu nehmen, während auf bereits etablierte Infrastruktur Kapital.
Introduction
Typische Sandwich-Immunoassays Erkennung indirekt die Anwesenheit eines Antigens unter Verwendung zweier Antikörper. Der Capture-Antikörper an eine feste Oberfläche gebunden und bildet einen Antikörper-Antigen-Komplexes, wenn sie in der Nähe einer geeigneten Antigen. Ein Detektionsantikörper wird dann eingeführt und bindet an das Antigen. Die Antikörper / Antigen / Antikörper – Komplex bleibt nach dem Waschen, und wird von dem markierten Nachweisantikörper nachgewiesen , wie in 1A gezeigt. Typische Nachweis wird durch einen fluoreszierenden oder kolorimetrischen Detektor durchgeführt, Multiplexing zu 10 Analyten aufgrund breiten spektralen Peaks 2,3 zu begrenzen. Im Gegensatz dazu haben Raman-basierten Systemen viel schmalere Emissionspeaks was zu verbesserten Multiplexierungsfähigkeiten mit Quellen beanspruchen simultanen Nachweis von bis zu 100 Analyte 2,3.
Viele Literaturquellen zur Verfügung , die wichtige Aspekte im Zusammenhang decken Immunoassays 4 – 6 wie Schritt- für -SchrittDetails personalisierte ELISA-Kits zu erstellen. Leider sind diese Protokolle für fluoreszierende oder kolorimetrische Detektion, Multiplexing-Fähigkeit von kundenspezifischen Immunoassays begrenzen. Um diesem Bedarf zu begegnen, stellen wir ein detailliertes Verfahren der UV-Vis / Raman – Immunoassay vorher 7 für einen direkten Immunoassay veröffentlicht herzustellen , wie in 1B dargestellt.
Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von funktionalisierten Goldnanopartikel-basierten Sonden, die in 2 dargestellt. Das Verfahren für die Raman / UV-Vis – Sonden zu machen beginnt durch Bindung Raman Reporter an der Oberfläche der Gold – Nanopartikel (AuNPs). Die AuNPs werden dann mit Antikörpern, die mit funktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) verbunden sind. Verbleibende Bindungsstellen auf den AuNPs werden durch Bindung Methoxypolyethylenglykol thiol (mPEG-SH) zu AuNPs blockiert nachfolgende unspezifische Bindung während der Analyse zu verhindern. Die hergestellten AuNP Sonden werden durch die Bindung an Antigene getestetwie dargestellt in Figur 1B zu den Vertiefungen einer Polystyrolplatte fixiert. Nach dem Waschen der Platte werden die AuNP Sonden unter Verwendung von UV-Vis-Spektroskopie, während die zugehörigen Raman-Reporter mit Raman-Spektroskopie detektiert werden. Die Kombination von UV-Vis und Raman-Spektraldaten bietet zwei Methoden von Analysen, die Fähigkeiten dieses Immunoassays zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem detaillierten Protokoll gibt es mehrere kritische Punkte abdecken. Ein Problem ist die Wahl der Raman-Reporter und Gold-Nanopartikel. Obwohl das Protokoll für den individuellen Gebrauch angepasst werden geschrieben wurde, wurde das Raman-Reporter DTTC als Beispiel verwendet. DTTC eine positiv geladene Reporter und bindet an negativ geladenen Oberflächen, wie Citrat capped AuNPs. Dieses Protokoll kann mit einer positiven Oberflächenladung durch Verwendung von Gold-Nanopartikeln für negativ geladene Reporter an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
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