A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Os imunoensaios são usados para detectar as proteínas com base na presença de anticorpos associados. Devido à sua ampla utilização na pesquisa e na clínica, uma grande infra-estrutura de instrumentos e materiais de imunoensaio pode ser encontrado. Por exemplo, 96 e 384 poços placas de poliestireno estão disponíveis comercialmente e têm um desenho padrão para acomodar máquinas de espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-VIS) de vários fabricantes. Além disso, uma grande variedade de imunoglobulinas, etiquetas de detecção, e os agentes de bloqueio para os desenhos de imunoensaio personalizadas, tais como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) estão disponíveis.
Apesar da infra-estrutura existente, kits de ELISA convencionais não satisfazem todas as necessidades de pesquisa, o que requer o desenvolvimento de imunoensaio individualizado, o que pode ser caro e demorado. Por exemplo, kits de ELISA têm baixa multiplexação (detecção de mais do que um analito ao mesmo tempo) como capacidades que geralmente dependem de fluorescência ou colorimetric métodos para a detecção. Colorimétrico e análises fluorescentes baseados em ter capacidades de multiplexação devido a grandes picos espectrais limitados. Em contraste, os métodos baseados em espectroscopia Raman tem uma capacidade muito maior para a multiplexação devido a picos de emissão estreitas. Outra vantagem da espectroscopia Raman é que os repórteres Raman experimentar significativamente menos fotodegradação do que marcadores fluorescentes 1. Apesar das vantagens que os repórteres Raman têm mais de marcadores fluorescentes e colorimétricos, protocolos para fabricar imunoensaios baseados em Raman são limitadas. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para preparar sondas funcionalizadas para usar em conjunto com placas de poliestireno para detecção direta de analitos por análise de UV-Vis e espectroscopia Raman. Este protocolo permitirá aos investigadores ter uma abordagem do-it-yourself para a detecção futuro multi-analito enquanto capitalizando sobre a infra-estrutura pré-estabelecida.
Introduction
imunoensaios de sanduíche típicos indirectamente detectar a presença de um antigénio utilizando dois anticorpos. O anticorpo de captura está ligada a uma superfície sólida e forma um complexo anticorpo-antigénio quando em proximidade com um antigénio apropriado. Um anticorpo de detecção é então introduzida e liga-se ao antigénio. Após a lavagem, o anticorpo / antigénio / anticorpo e continua a ser complexo é detectada pelo anticorpo de detecção marcado, como demonstrado na Figura 1A. Detecção típica é feita por um detector fluorescente ou colorimétrico, o que limita a multiplexagem 10 substância a analisar devido aos picos largos espectrais 2,3. Em contraste, os sistemas baseados em Raman têm picos de emissão muito estreitos, resultando em capacidades de multiplexação reforçadas com fontes que reivindicam a detecção simultânea de até 100 analitos 2,3.
Muitas fontes bibliográficas estão disponíveis, que abrangem aspectos importantes relacionados com imunoensaios 4-6, como passo-a-passodetalhes para criar kits personalizados ELISA. Infelizmente, estes protocolos são para a detecção fluorescente ou colorimétrico, limitando a capacidade de multiplexação de imunoensaios personalizadas. Para atender a essa necessidade, apresentamos um procedimento detalhado para fabricar o UV-Vis / Raman imunoensaio publicado anteriormente 7 para um imunoensaio directo conforme ilustrado na figura 1B.
Este protocolo inclui a fabricação de sondas de nanopartulas de ouro baseia-funcionalizado, ilustrada na Figura 2. O procedimento para fazer as sondas / UV-Vis Raman começa pela ligação repórteres Raman para a superfície de nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são depois funcionalizadas com anticorpos que estão associadas com polietileno glicol (PEG). Os restantes locais de ligação no AuNPs são bloqueadas por ligação tiol metoxi polietileno glicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar a ligação não-específica subsequente durante a análise. As sondas AUNP preparadas são testada por ligação a antigéniosfixa-se aos poços de uma placa de poliestireno, tal como ilustrado na Figura 1B. Após lavagem da placa, as sondas AUNP são detectados utilizando espectroscopia de UV-Vis, enquanto os repórteres Raman associados são detectados com espectroscopia de Raman. Combinando os dados UV-Vis e Raman espectral fornece dois métodos de análise, reforçando as capacidades deste imunoensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
No protocolo detalhado, existem vários pontos críticos para tratar. Uma questão é a escolha do repórter Raman e nanopartículas de ouro. Embora o protocolo foi escrito para ser adaptado para o uso individual, a Raman DCTC repórter foi utilizada como um exemplo. DTTC é um repórter carregado positivamente e se liga a superfícies tais como citrato tampado AuNPs carregado negativamente. Este protocolo pode ser adaptado para repórteres negativamente carregados usando nanopartículas de ouro com uma carga de superf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
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