एक यूवी विज़ और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी Immunoassay प्लेटफार्म fabricating
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immunoassays जुड़े एंटीबॉडी की उपस्थिति के आधार पर प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग में उनकी व्यापक उपयोग के कारण, प्रतिरक्षा उपकरणों और सामग्री की एक बड़ी बुनियादी ढांचा पाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 96 और 384 अच्छी तरह से polystyrene प्लेटें उपलब्ध व्यावसायिक तौर पर कर रहे हैं और विभिन्न निर्माताओं से पराबैंगनी दिखाई (यूवी विज़) स्पेक्ट्रोस्कोपी मशीनों को समायोजित करने के लिए एक मानक डिजाइन किया है। इसके अलावा, इम्युनोग्लोबुलिन, पता लगाने टैग, और इस तरह के एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (एलिसा) के रूप में अनुकूलित प्रतिरक्षा डिजाइन के लिए अवरुद्ध एजेंटों की एक विस्तृत विविधता में उपलब्ध हैं।
मौजूदा बुनियादी ढांचे के बावजूद, मानक एलिसा किट सभी अनुसंधान की जरूरत को पूरा नहीं करते, व्यक्तिगत प्रतिरक्षा विकास है, जो महंगा है और समय लेने वाली हो सकती है की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एलिसा किट कम बहुसंकेतन (एक समय में एक से अधिक analyte का पता लगाने के) क्षमता है क्योंकि वे आम तौर प्रतिदीप्ति या कर्नल पर निर्भरपता लगाने के लिए orimetric तरीकों। Colorimetric और फ्लोरोसेंट आधारित विश्लेषण व्यापक वर्णक्रम चोटियों के कारण बहुसंकेतन क्षमताओं को सीमित कर दिया है। इसके विपरीत, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी आधारित विधियों संकीर्ण उत्सर्जन चोटियों के कारण बहुसंकेतन के लिए एक बहुत बड़ी क्षमता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक अन्य लाभ यह है कि रमन ने संवाददाताओं से फ्लोरोसेंट टैग 1 की तुलना में काफी कम photobleaching का अनुभव है। लाभ में फ्लोरोसेंट और वर्णमिति टैग से अधिक है कि रमन ने संवाददाताओं के बावजूद, प्रोटोकॉल के निर्माण के लिए रमन आधारित immunoassays सीमित हैं। इस पत्र का उद्देश्य यूवी विज़ विश्लेषण और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा analytes की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए polystyrene प्लेटों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के क्रियाशील जांच तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इस प्रोटोकॉल जबकि पूर्व स्थापित बुनियादी ढांचे पर capitalizing शोधकर्ताओं भविष्य बहु analyte का पता लगाने के लिए एक है, यह अपने आप दृष्टिकोण लेने की अनुमति होगी।
Introduction
ठेठ सैंडविच immunoassays परोक्ष रूप से एक प्रतिजन दो एंटीबॉडी का उपयोग की उपस्थिति का पता लगाने। कब्जा एंटीबॉडी एक ठोस सतह के लिए बाध्य है और एक उचित प्रतिजन के लिए एक एंटीबॉडी प्रतिजन जटिल निकटता में जब रूपों है। एक का पता लगाने एंटीबॉडी तो शुरू की है और प्रतिजन को बांधता है। धोने के बाद, एंटीबॉडी / प्रतिजन / एंटीबॉडी जटिल बनी हुई है और लेबल का पता लगाने के एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया के रूप में चित्रा 1 ए में प्रदर्शन किया है। ठेठ का पता लगाने के एक फ्लोरोसेंट या वर्णमिति डिटेक्टर द्वारा किया जाता है, 10 व्यापक वर्णक्रम चोटियों 2,3 के कारण analytes को बहुसंकेतन सीमित। इसके विपरीत, रमन आधारित प्रणाली बहुत संकरा उत्सर्जन करने के लिए 100 analytes 2,3 के एक साथ पता लगाने का दावा स्रोतों के साथ बढ़ाया बहुसंकेतन क्षमताओं में जिसके परिणामस्वरूप चोटियों है।
कई साहित्य स्रोतों उपलब्ध है जो Immunoassays से संबंधित महत्वपूर्ण पहलुओं को कवर कर रहे 4 – 6 ऐसे कदम-दर-कदम के रूप मेंजानकारी के व्यक्तिगत एलिसा किट बनाने के लिए। दुर्भाग्य से, इन प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट या वर्णमिति पता लगाने के लिए कर रहे हैं, अनुकूलित immunoassays की बहुसंकेतन क्षमता सीमित है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम यूवी विज़ / रमन प्रतिरक्षा एक सीधा प्रतिरक्षा के लिए पहले से 7 प्रकाशित के रूप में चित्रा 1 बी में सचित्र निर्माण करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।
इस प्रोटोकॉल क्रियाशील सोने nanoparticle आधारित जांच के निर्माण, चित्रा 2 में सचित्र प्रक्रिया सोने के नैनोकणों की सतह (AuNPs) के लिए रमन ने संवाददाताओं को बंधन से शुरू होता रमन / यूवी विज़ जांच करने के लिए भी शामिल है।। AuNPs तो यह है कि पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ जुड़े रहे हैं एंटीबॉडी के साथ क्रियाशील रहे हैं। AuNPs पर शेष बाध्यकारी साइटों AuNPs को methoxy पॉलीथीन ग्लाइकोल thiol (एमपीईजी एसएच) बाध्यकारी विश्लेषण के दौरान बाद में गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं। तैयार AuNP जांच एंटीजन के बंधन से परीक्षण कर रहे हैंएक polystyrene प्लेट के कुओं के लिए तय रूप में चित्रा 1 बी में सचित्र। प्लेट धोने पर, AuNP जांच यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पाया जाता है, जबकि जुड़े रमन ने संवाददाताओं से रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ पाया जाता है। यूवी विज़ और रमन वर्णक्रमीय डेटा का मेल है, विश्लेषण के दो तरीके प्रदान करता है इस प्रतिरक्षा की क्षमताओं को बढ़ाना।
Protocol
Representative Results
Discussion
विस्तृत प्रोटोकॉल में, वहाँ कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को संबोधित करने के लिए कर रहे हैं। एक मुद्दा रमन रिपोर्टर और सोने nanoparticle की पसंद है। हालांकि प्रोटोकॉल व्यक्तिगत उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा करने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
