Fabrikere en UV-Vis og Raman spektroskopi Immunoassay Platform

Summary

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Abstract

Immunoanalyser benyttes for å påvise proteiner basert på tilstedeværelsen av tilknyttede antistoffer. På grunn av deres omfattende anvendelse i forskning og kliniske miljøer, kan en stor infrastruktur av immunoassay-instrumenter og materialer funnet. For eksempel, 96- og 384-brønnen polystyren plater er tilgjengelig kommersielt og har en standard design for å imøtekomme ultrafiolette synlig (UV-VIS) spektroskopi maskiner fra forskjellige produsenter. I tillegg er et bredt utvalg av immunoglobuliner, deteksjon koder, og blokkeringsmidler for tilpassede immunoassay-motiver som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er tilgjengelige.

Til tross for den eksisterende infrastrukturen, trenger standard ELISA-sett ikke tilfredsstiller alle forskningsbehov, noe som krever individualisert immunoanalyse utvikling, noe som kan være kostbart og tidkrevende. For eksempel, ELISA-sett har lav multipleksing (deteksjon av mer enn en analytt av gangen) evner som de vanligvis avhenge av fluorescens eller colorimetric metoder for påvisning. Kolo og fluorescerende baserte analyser har begrenset multiplexing evner på grunn av brede spektrale topper. I motsetning til dette, Raman-spektroskopi-baserte metoder har en meget større evne for multipleksing på grunn av trange emisjonstoppene. En annen fordel med Raman spektroskopi er at Raman journalister opplever betydelig mindre fotobleking enn fluorescerende tagger ^1. Til tross for de fordeler som Raman journalister har over lysrør og kolorimetriske koder, protokoller dikte Raman-baserte immunologiske analyser er begrenset. Formålet med denne artikkelen er å tilveiebringe en protokoll for å fremstille funksjonaliserte prober å bruke i forbindelse med polystyren plater for direkte påvisning av analytter ved UV-Vis-analyse og Raman-spektroskopi. Denne protokollen vil tillate forskere å ta en gjør-det-selv-tilnærming for fremtiden multi-analytt deteksjon mens utnytte pre-etablert infrastruktur.

Introduction

Typiske sandwich-immunoanalyser indirekte detektere nærværet av et antigen ved anvendelse av to antistoffer. Fangst-antistoffet er bundet til en fast overflate og danner et antistoff-antigen kompleks når den er i nærheten av en passende antigen. En deteksjonsantistoff blir så innført og binder seg til antigenet. Etter vasking blir de antistoff / antigen / antistoff-komplekset levninger og detekteres av den merkede påvisningsantistoff som vist i figur 1A. Typisk deteksjon gjøres av et fluoriserende eller kolorimetrisk detektor, noe som begrenser multipleksing til 10 analyttene på grunn av brede spektraltopper ^2,3. I motsetning til dette, Raman-baserte systemer har mye smalere emisjonstoppene som resulterer i forbedrede multipleksing muligheter med kilder som hevder simultan deteksjon av opptil 100 analytter ^2,3.

Mange litteraturkilder er tilgjengelige som dekker viktige aspekter knyttet til immunoanalyser ^{4. – 6.} såsom steg-for-stegdetaljer for å lage personlige ELISA kits. Dessverre er disse protokollene er for fluorescerende eller kolo deteksjon, noe som begrenser multipleksing evnen til tilpassede immunanalyser. For å møte dette behovet, presenterer vi en detaljert fremgangsmåte for å fremstille UV-Vis / Raman-immunoassay publisert tidligere ⁷ for en direkte immunoanalyse som illustrert i figur 1B.

Denne protokollen innbefatter fremstilling av funksjonaliserte gull nanopartikkel-baserte prober, er vist på figur 2. Fremgangsmåten for å lage den Raman / UV-Vis-prober begynner ved binding Raman reportere til overflaten av gull nanopartikler (AuNPs). De AuNPs blir deretter funksjonalisert med antistoffer som er forbundet med polyetylenglykol (PEG). Gjenværende bindingsseter på de AuNPs blokkeres ved binding metoksypolyetylenglykol tiol (mPEG-SH) til AuNPs for å forhindre etterfølgende ikke-spesifikk binding under analysen. De forberedt AuNP sonder er testet ved binding til antigenerfestet til brønnene i en polystyren plate som illustrert i figur 1B. Ved vasking av platen, blir AuNP sondene oppdaget ved hjelp av UV-Vis-spektroskopi mens de tilknyttede Raman journalister blir oppdaget med Raman-spektroskopi. Kombinere UV-Vis og Raman spektrale data gir to metoder for analyser, forbedre egenskapene denne immunoassay.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere Fosfatbufret saltløsning (PBS) Fortynn 50 ml 10 x PBS med 450 ml HPLC-kvalitet vann for å lage en 1 x PBS konsentrasjon. Sterilt filter oppløsningen med et 0,22 um filter. Lagres oppløsning ved romtemperatur. Utarbeidelse av Tris bufret saltvann + Tween 20 (TBST) Fortynn 50 ml 10 x Tris-buffret saltvann (TBS) med 450 ml HPLC-kvalitet vann for å lage en 1x konsentrasjon. Tilsett 250 ul av Tween-20 …

Representative Results

I denne studien ble 60 nm gullpartikler anvendes for UV-vis spektroskopi. UV-Vis absorpsjon spektra fra 400 til 700 nm ble samlet inn og topparealene for hvert AuNP konsentrasjon ble bestemt ved hjelp av åpen kildekode spektralanalyse programvare 8. Før topp integrasjon, samlet spektra gikk baseline korreksjon ved hjelp av en tre-punkts eksakt tilpasning. Topparealene ble brukt til å generere en logaritmisk kalibreringskurve som vist i figur 4. Det skal bemerkes at figurene 4</stro…

Discussion

I den detaljerte protokollen, er det flere viktige punkter til adressen. Ett problem er valget av Raman reporter og gull nanopartikler. Selv om protokollen ble skrevet for å være tilpasset for individuell bruk, ble den Raman reporteren DTTC brukt som et eksempel. DTTC er et positivt ladet reporter og binder seg til negativt ladet overflater som citrate avkortet AuNPs. Denne protokollen kan tilpasses for negativt ladet journalister ved hjelp av gull nanopartikler med en positiv overflateladning. For eksempel, polyetyle…

Materials

60nm Gold Nanoparticle	Ted Pella, Inc.	15708-6	These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Methanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5	Scy Tek	TBD999
Bottle Top Filtration Unit	VWR	97066-202
Tween 20 (polysorbate 20)	Scy Tek	TWN500	Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf Tubes	22431102	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf Tubes	22431064	LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom	Costar	3370
HPLC grade water	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	31164	Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution	Sigma Aldrich	A1887-1G	Bovine serum albumin can be used instead.
In-house built 785nm inverted Raman microscope unit	N/A	N/A	An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.
Mini Centrifuge	Fisher Schientific	12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer	BioTek	Synergy 2
Desalting Columns	Thermor Scientific	87766