Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Immunoanalyser benyttes for å påvise proteiner basert på tilstedeværelsen av tilknyttede antistoffer. På grunn av deres omfattende anvendelse i forskning og kliniske miljøer, kan en stor infrastruktur av immunoassay-instrumenter og materialer funnet. For eksempel, 96- og 384-brønnen polystyren plater er tilgjengelig kommersielt og har en standard design for å imøtekomme ultrafiolette synlig (UV-VIS) spektroskopi maskiner fra forskjellige produsenter. I tillegg er et bredt utvalg av immunoglobuliner, deteksjon koder, og blokkeringsmidler for tilpassede immunoassay-motiver som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er tilgjengelige.
Til tross for den eksisterende infrastrukturen, trenger standard ELISA-sett ikke tilfredsstiller alle forskningsbehov, noe som krever individualisert immunoanalyse utvikling, noe som kan være kostbart og tidkrevende. For eksempel, ELISA-sett har lav multipleksing (deteksjon av mer enn en analytt av gangen) evner som de vanligvis avhenge av fluorescens eller colorimetric metoder for påvisning. Kolo og fluorescerende baserte analyser har begrenset multiplexing evner på grunn av brede spektrale topper. I motsetning til dette, Raman-spektroskopi-baserte metoder har en meget større evne for multipleksing på grunn av trange emisjonstoppene. En annen fordel med Raman spektroskopi er at Raman journalister opplever betydelig mindre fotobleking enn fluorescerende tagger 1. Til tross for de fordeler som Raman journalister har over lysrør og kolorimetriske koder, protokoller dikte Raman-baserte immunologiske analyser er begrenset. Formålet med denne artikkelen er å tilveiebringe en protokoll for å fremstille funksjonaliserte prober å bruke i forbindelse med polystyren plater for direkte påvisning av analytter ved UV-Vis-analyse og Raman-spektroskopi. Denne protokollen vil tillate forskere å ta en gjør-det-selv-tilnærming for fremtiden multi-analytt deteksjon mens utnytte pre-etablert infrastruktur.
Typiske sandwich-immunoanalyser indirekte detektere nærværet av et antigen ved anvendelse av to antistoffer. Fangst-antistoffet er bundet til en fast overflate og danner et antistoff-antigen kompleks når den er i nærheten av en passende antigen. En deteksjonsantistoff blir så innført og binder seg til antigenet. Etter vasking blir de antistoff / antigen / antistoff-komplekset levninger og detekteres av den merkede påvisningsantistoff som vist i figur 1A. Typisk deteksjon gjøres av et fluoriserende eller kolorimetrisk detektor, noe som begrenser multipleksing til 10 analyttene på grunn av brede spektraltopper 2,3. I motsetning til dette, Raman-baserte systemer har mye smalere emisjonstoppene som resulterer i forbedrede multipleksing muligheter med kilder som hevder simultan deteksjon av opptil 100 analytter 2,3.
Mange litteraturkilder er tilgjengelige som dekker viktige aspekter knyttet til immunoanalyser 4. – 6. såsom steg-for-stegdetaljer for å lage personlige ELISA kits. Dessverre er disse protokollene er for fluorescerende eller kolo deteksjon, noe som begrenser multipleksing evnen til tilpassede immunanalyser. For å møte dette behovet, presenterer vi en detaljert fremgangsmåte for å fremstille UV-Vis / Raman-immunoassay publisert tidligere 7 for en direkte immunoanalyse som illustrert i figur 1B.
Denne protokollen innbefatter fremstilling av funksjonaliserte gull nanopartikkel-baserte prober, er vist på figur 2. Fremgangsmåten for å lage den Raman / UV-Vis-prober begynner ved binding Raman reportere til overflaten av gull nanopartikler (AuNPs). De AuNPs blir deretter funksjonalisert med antistoffer som er forbundet med polyetylenglykol (PEG). Gjenværende bindingsseter på de AuNPs blokkeres ved binding metoksypolyetylenglykol tiol (mPEG-SH) til AuNPs for å forhindre etterfølgende ikke-spesifikk binding under analysen. De forberedt AuNP sonder er testet ved binding til antigenerfestet til brønnene i en polystyren plate som illustrert i figur 1B. Ved vasking av platen, blir AuNP sondene oppdaget ved hjelp av UV-Vis-spektroskopi mens de tilknyttede Raman journalister blir oppdaget med Raman-spektroskopi. Kombinere UV-Vis og Raman spektrale data gir to metoder for analyser, forbedre egenskapene denne immunoassay.
I den detaljerte protokollen, er det flere viktige punkter til adressen. Ett problem er valget av Raman reporter og gull nanopartikler. Selv om protokollen ble skrevet for å være tilpasset for individuell bruk, ble den Raman reporteren DTTC brukt som et eksempel. DTTC er et positivt ladet reporter og binder seg til negativt ladet overflater som citrate avkortet AuNPs. Denne protokollen kan tilpasses for negativt ladet journalister ved hjelp av gull nanopartikler med en positiv overflateladning. For eksempel, polyetyle…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |