A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são potencialmente responsáveis por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante. Os biofilmes tem exibido uma tolerância excepcionalmente elevada de quimioterapia, que se pensa ser multifactorial. Por exemplo, a matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada. Provavelmente, o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação destes e de outros, ainda desconhecidos, mecanismos. Todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra-células individuais (bactérias planctónicas). Portanto, até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente. Um desafio adicional é que há umnúmero de métodos padronizados para a investigação de biofilme, especialmente aqueles que podem ser utilizados para o rastreio de grande rendimento de bibliotecas químicas muito limitado. Aqui, uma plataforma de anti-biofilme experimental para filtragem de produtos químicos é apresentada. Coloração Ela usa três ensaios para medir a viabilidade do biofilme (coloração com resazurina), biomassa total (com coloração de violeta de cristal) e matriz do biofilme (usando uma aglutinina de gérmen de trigo, com sede em WGA-fluorescência do poli-N-acetil-glucosamina, PNAG , fração). Todos os ensaios foram desenvolvidos utilizando Staphylococcus aureus como as bactérias modelo. Exemplos de como a plataforma pode ser utilizada para rastreio primário, bem como para a caracterização funcional de acessos identificados anti-biofilme são apresentados. Esta sequência experimental permite ainda a classificação dos hits com base nos pontos finais medidos. Ele também fornece informações sobre o seu modo de acção, especialmente no longo prazo contra os efeitos quimioterápicos de curto prazo. Assim, é muito advantageous para a rápida identificação de compostos de vida de alta qualidade que podem servir como pontos de partida para várias aplicações biomédicas.
Introduction
As bactérias podem alternar entre dois estilos de vida muito diferentes, planctônicas e sessile, dos quais um biofilme é o exemplo mais comum. Em biofilmes, as bactérias formarem comunidades estruturadas embebidas numa matriz auto-produzido um. Esta matriz auto-produzido é uma barreira entre as bactérias e seu ambiente externo, e que protege as células microbianas, mantê-los na proximidade. A composição da matriz do biofilme varia entre e dentro das espécies, mas a maioria é constituída de uma forte rede de lipopolissacarídeos, ADN extracelular e proteínas. A matriz serve como uma barreira física inibir a entrada de agentes nocivos, mas também protege o biofilme de desidratação e impede que os nutrientes se escape da célula 2.
Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são supostamente responsáveis por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante 3. eles dispestabelecer uma tolerância inerentemente alta contra ameaças externas: umidade, pressão osmótica, estresse mecânico 4, calor, radiação UV 5, desinfectantes, agentes antimicrobianos e o sistema imune do hospedeiro 1. Por exemplo, a concentração de agente antimicrobiano necessária requerida para matar um biofilme tem sido mostrado para ser de até 1000 vezes mais elevada em comparação com a necessária para matar bactérias planctónicas. A explicação para essa maior tolerância parece ser multifatorial. A matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada; eles transição entre diferentes estados metabólicos devido a um gradiente existente de oxigénio, nutrientes, metabolitos e entre as partes interior e exterior do biofilme 6. Assim, em algumas regiões do biofilme, como o núcleo, as bactérias são privadas de oxigênio e nutrientes e vive em um metabolicamente menos ativo ou um estado completamente adormecida <sup> 7. As células totalmente dormentes são referidas como células Persister, e eles não são sensíveis a tratamentos antimicrobianos convencionais 8. Assim, é provável que o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação dos mecanismos presentemente sugeridas e outras, ainda desconhecidos,. Staphylococcus spp. ainda estão entre as bactérias gram-positivas mais problemáticas, causando graves, muitas vezes relacionados com o biofilme, infecções 4. Sugere-se que até 99% de todas as bactérias estão associadas dentro de biofilmes, tornando-o estilo de vida bacteriana predominante 3. No entanto, todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra bactérias unicelulares (planctônicas). Até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente.
De um methodologperspectiva iCal, existem desafios adicionais, já que apenas um número limitado de métodos de biofilme foram desenvolvidos por organizações de normalização, especialmente aqueles aplicáveis ao rastreio de alto rendimento de bibliotecas químicas. Todos os ensaios normalizados (com apenas uma excepção) baseiam-se em reactores de biofilme, e estes métodos requerem grandes volumes de trabalho e grandes quantidades de compostos a serem testados, que são normalmente não disponível durante a fase precoce investigacional 9-12. O ensaio de rastreio-aplicável padronizado única existente é o assim chamado dispositivo de Calgary biofilme, a partir do qual o sistema disponível comercialmente biofilme eliminando concentração mínima (MBEC) foi desenvolvido 13-15. No entanto, a limitação deste ensaio é que os biofilmes são cultivadas em estacas, e nem todas as espécies bacterianas ou mesmo estirpes da mesma espécie são capazes de formar biofilmes sobre este dispositivo. Além disso, os métodos que podem ser especialmente aplicados para a exploração de compostos naturais sãonecessário. Produtos naturais têm sido a principal fonte de inovação na descoberta de medicamentos antimicrobianos durante o último século 16. Eles podem fornecer compostos anti-biofilme com novos mecanismos de acção único que também pode ser eficaz contra células Persister. Assim, a exploração de bibliotecas naturais e inspirados na natureza tem grandes chances de produzir leads anti-biofilme promissores e originais.
Aqui, apresentam-se os pormenores experimentais de uma plataforma de ensaios que foi desenvolvido para o rastreio de compostos químicos anti-biofilme usando três ensaios para medir os efeitos sobre a viabilidade, a biomassa total, e a matriz do biofilme Staphylococcus aureus. O primeiro ensaio mede a viabilidade do biofilme, e que se baseia na coloração resazurina. Resazurina é um corante redox azul e que é não fluorescente no seu estado oxidado e transforma-se em cor de rosa resorufina, altamente fluorescente quando reduzida pela actividade metabólica das bactérias. É um m muito simples e rápidoétodo adequado para exames preliminares 17-20. O segundo ensaio, com base na coloração de violeta de cristal, mede massa total do biofilme. Cristal violeta é uma mancha amplamente utilizado para estudar as bactérias e bactérias em biofilmes 19,21-23. O ensaio baseia-se reagentes baratos e tem um ponto de extremidade simples leitura de absorvância. Finalmente, o terceiro ensaio tem como alvo o -matrix extracelular substância polimérica (EPS) do biofilme através de aglutinina de gérmen de trigo (WGA), que se liga especificamente a poli- resíduos de glucosamina N-acetil-(PNAG) presentes na matriz do biofilme estafilocócicas 24. A WGA é conjugado com um fluoróforo, que pode ser detectado utilizando leitores de intensidade de fluorescência 25. Apresentamos aqui a lógica e os detalhes da plataforma que desenvolvemos, incluindo exemplos de aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Não há nenhum método único que pode medir simultaneamente o efeito de um composto sobre a viabilidade, a biomassa, e a matriz do biofilme. Por conseguinte, existe uma necessidade para a combinação de ensaios, a fim de detectar um efeito sobre os três pontos de extremidade, de preferência a uma etapa de rastreio primário.
Resazurina é um protocolo de coloração muito simples, consistindo apenas da adição da sonda redox. No entanto, o estabelecimento do tempo de incubação óptim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o professor Paul Cos e LMPH, Universidade de Antuérpia, Bélgica por seu apoio durante o processo de filmagem em seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Academia de projectos Finlândia (projectos 272266 e 282981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlândia. As contribuições técnicas de MSc Janni Kujala são reconhecidas.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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