Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir, ve potansiyel antibiyotik dayanıklı enfeksiyonların% 80'i sorumludur. Biyofilm multifaktöryeldir olduğu düşünülen kemoterapi için olağanüstü yüksek tolerans, göstermiştir. Örneğin, matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir. Büyük olasılıkla, biyofilm esnekliği bu ve diğer, henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan kaynaklanır. Şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreleri (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır. Ek bir zorluk olmasıdırÇok biyofilm araştırma için standart yöntemler, kimyasal kütüphaneler büyük hacimli tarama için kullanılabileceğini özellikle sınırlı sayıda. Burada, kimyasal tarama için deneysel bir anti-biyofilm platformu sunulmuştur. Poli N-asetil-glukozamin, PNAG ait bir buğday tohumu agglutinin kullanarak biyofilm (resazurin boyama ile) canlılığı, (kristal viyole boyama ile) toplam biyokütle ve biyofilm matrisi (ölçmek için üç deneyleri kullanır, WGA-floresan tabanlı boyama , fraksiyon). Tüm deneyler modeli bakteriler gibi Staphylococcus aureus kullanılarak geliştirilmiştir. Platform primer tarama için de tanımlanan anti-biyofilm hit fonksiyonel karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini örnekleri sunulmaktadır. Bu deneysel sekansı ölçülen son noktaları dayalı isabet sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, özellikle kısa süreli kemoterapötik etkilerinin karşılaştırılması, uzun vadede, etki biçimleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, çok Adva olançeşitli biyomedikal uygulamalar için başlangıç noktası hizmet verebilir yüksek kaliteli isabet bileşiklerinin hızlı belirlenmesi için ntageous.
Introduction
Bakteriler biyofilm en yaygın örneği olan iki çok farklı yaşam tarzları, planktonik ve sapsız, arasında geçiş yapabilirsiniz. Biyofilmlererde, bakteriler kendi ürettiği matrise 1 gömülü yapısal toplulukları oluştururlar. Bu kendi ürettiği matris bakteri ve dış çevre arasında bir bariyer olduğunu ve yakın tutarak, mikrobiyal hücreleri korur. biyofilm matrisin bileşimi ile ve hatta türler içinde değişir, ama daha çok lipopolisakaritler, hücre dışı DNA ve protein sıkı ağından oluşur. Matris zararlı maddelerin girişini engelleyerek fiziksel bir bariyer görevi görür, ama aynı zamanda dehidrasyon biyofilm korur ve hücre 2 kaçan besin önler.
Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir ve bunlar antibiyotik dayanıklı enfeksiyonlarda 3% 80'i için ileri sürülen sorumludur. onlar dispnem, osmotik basınç, mekanik stres 4, ısı, UV radyasyonu 5, dezenfektanlar, antimikrobiyal ajanlar, ve ev sahibi bağışıklık sistemi 1: dış tehditlere karşı doğal olarak yüksek tolerans yatıyordu. Örneğin, bir biyofilm öldürmek için gerekli gerekli antimikrobiyel madde konsantrasyonu, planktonik bakterileri öldürmek için gerekene göre en fazla 1000 kat daha yüksek olduğu gösterilmiştir. bu daha yüksek tolerans açıklaması çok faktörlü olduğu görülmektedir. matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir; onlar yüzünden biyofilm 6 iç ve dış kısımları arasındaki oksijen, besin ve metabolitleri varolan degrade farklı metabolik durumları arasında geçiş. Dolayısıyla, bu tür çekirdek gibi bazı biyofilm bölgelerde, bakteri oksijen ve besin yoksun ve bir metabolik az aktif ya da tamamen atıl devlet içinde yaşamak <sup> 7. Tamamen atıl hücreleri gibi persister hücreleri de ifade edilir ve geleneksel antimikrobiyal tedavi 8 duyarlı değildir. Nedenle, biyofilm esnekliği halihazırda, önerilen ve diğer henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan ortaya olasıdır. Staphylococcus spp. Şiddetli, sık sık biyofilm ilgili, enfeksiyonlara 4 neden en sorunlu gram pozitif bakteriler arasında devam etmektedir. Tüm bakterilerin% 99'a kadar daha baskın bakteri yaşam tarzı 3 yaparak, biyofilm içinde ilişkili olduğu ileri sürülmektedir. Ancak, şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreli (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Şu ana kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır.
Bir methodolog itibarenbiyofilm yöntemler sadece sınırlı sayıda standart koyucu kuruluşlar, kimyasal kütüphanelerin yüksek verimli tarama için geçerli özellikle geliştirilmiştir gibi nik perspektif bir ek zorluklar mevcuttur. (Sadece bir istisna dışında) Bütün standart deneyler biyofilm reaktörleri dayalı ve bu yöntemler genellikle erken evrede araştırma 9-12 sırasında kullanılamaz geniş çalışma hacimleri ve test edilecek bileşiklerin büyük miktarda gerektirir. Yalnızca mevcut standart bir tarama uygulanamaz deney ticari olarak temin edilebilen en az biyofilm ortadan konsantrasyonu (MBEC) Sistem 13-15 geliştirilmiş olan sözde Calgary Biyofilm cihazdır. Ancak, bu testin sınırlama biyofilm mandal yetiştirilen ve tüm bakteri türleri ya da aynı türün içindeki bile suşları değil bu cihazda biyofilm oluşturmak mümkün olmasıdır. Ayrıca, özellikle de doğal bileşiklerin keşfi uygulanabilir yöntemlerdirgerekli. Doğal ürünler Geçen yüzyılda üzerinde 16 antimikrobiyal ilaç keşfi yenilik için önemli bir kaynak olmuştur. Ayrıca persister hücrelere karşı etkili olabilir etki benzersiz mekanizmaları, yeni anti-biyofilm bileşikler sağlayabilir. Böylece, doğal ve doğadan ilham kütüphanelerin keşif umut verici ve benzersiz anti-biyofilm potansiyel üreten yüksek şansı var.
Burada, Staphylococcus aureus biyofilm canlılığı, toplam biyokütle ve matris üzerinde etkilerini ölçmek için üç deneyleri kullanılarak anti-biyofilm bileşiklerin kimyasal taranması için geliştirilen testlerin bir platform deneysel ayrıntıları sunuyoruz. İlk deney biyofilm canlılığını ölçen ve resazurin boyama dayanır. Resazurin onun oksitlenmiş halde mavi ve floresan olmayan ve bakteri metabolik aktivitesi azalır zaman pembe, yüksek floresan resorufine dönüşen bir redoks leke olduğunu. Bu çok basit ve hızlı mBirincil gösterimleri 17-20 için müsait bu yöntemde. İkinci deney, kristal mor boyama dayalı olarak, toplam biyofilm kütlesi ölçer. Kristal viyole biyofilm 19,21-23 bakteri ve bakteri çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir leke olduğunu. Tahlil ucuz reaktif dayalı ve basit bir emme uç okuma vardır. Son olarak, üçüncü deney stafilokok biyofilm 24 matrisi içinde mevcut N-asetil-glukozamin (PNAG) poli- spesifik olarak bağlanan buğday tohumu agglutinin ile biyofilm (WGA), hücre-dışı polimerik madde (EPS) -Matris hedeflemektedir. WGA floresan yoğunluğu okuyucu 25 ile tespit edilebilen bir florofor ile konjuge edilir. Biz burada mantığını ve uygulama örnekleri de dahil olmak üzere, geliştirilen platformun detaylarını sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aynı anda canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde bir bileşiğin etkisini ölçmek tek yöntem yoktur. Bu nedenle, tercih edilen birincil tarama aşamasında, üç uç noktası üzerinde bir etki tespit etmek için deneyler ile birleştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Resazurin, yalnızca redoks probun ilavesinden oluşan çok basit boyama protokolüdür. Ancak, resazurin ile biyofilm optimal inkübasyon süresi kuran bu testin başarısı için çok önemlidir. Bazılarında…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kendi laboratuvarında filme sürecinde verdiği destekten ötürü profesörü Paul Kos ve LMPH, Antwerp Üniversitesi, Belçika teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya projeleri Akademisi (272266 ve 282981 projeleri) ve Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandiya tarafından finanse edildi. Yüksek Lisans Janni Kujala teknik katkıları kabul edilmektedir.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
