Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son potencialmente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes. Biofilms han mostrado una tolerancia excepcionalmente alta para la quimioterapia, que se cree que es multifactorial. Por ejemplo, la matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa. Probablemente, la capacidad de recuperación de biopelícula surge de una combinación de estos y otros, todavía desconocidos, mecanismos. Todos los antibióticos existentes en la actualidad se han desarrollado contra-unicelulares (bacterias planctónicas). Por lo tanto, hasta el momento, un repertorio muy limitado de moléculas existe que pueden actuar selectivamente sobre biofilms maduros. Esta situación ha llevado a un cambio de paradigma progresivo en el descubrimiento de fármacos, en la que se ha instado a la búsqueda de anti-biopelículas a ocupar un lugar más prominente. Un reto adicional es que hay unanúmero de métodos estandarizados para la investigación de biopelículas, especialmente aquellos que pueden ser utilizados para el cribado a gran rendimiento de bibliotecas químicas muy limitado. Aquí, se presenta una plataforma anti-biofilm experimental para la detección química. Utiliza tres ensayos para medir la viabilidad biofilm (con la tinción de la resazurina), la biomasa total (con tinción con violeta cristal), y la matriz de la biopelícula (usando una aglutinina de germen de trigo, basado-WGA-fluorescencia de tinción de la poli- N -acetil-glucosamina, PNAG , fracción). Todos los ensayos se desarrollaron utilizando Staphylococcus aureus como bacteria modelo. Se presentan ejemplos de cómo la plataforma puede ser utilizado para el cribado primario, así como para la caracterización funcional de los accesos identificados anti-biopelícula. Esta secuencia experimental permite además para la clasificación de los golpes sobre la base de los puntos finales medidos. También proporciona información sobre su modo de acción, especialmente en el largo plazo frente a los efectos de quimioterapia a corto plazo. Por lo tanto, es muy Advantageous para la identificación rápida de los compuestos de golpe de alta calidad que pueden servir como puntos de partida para diversas aplicaciones biomédicas.
Introduction
Las bacterias pueden cambiar entre dos estilos de vida muy diferentes, planctónicas y sésiles, de los cuales un biofilm es el ejemplo más común. En biofilms, las bacterias forman comunidades estructuradas embebidas en una matriz de producción propia 1. Esta matriz de producción propia es una barrera entre las bacterias y su entorno exterior, y protege las células microbianas, manteniéndolos en las proximidades. La composición de la matriz del biofilm varía entre, e incluso dentro de cada especie, pero en su mayoría se compone de una estrecha red de lipopolisacáridos, ADN extracelular y proteínas. La matriz sirve como una barrera física la inhibición de la entrada de agentes nocivos, sino que también protege la biopelícula de la deshidratación y evita que los nutrientes se escape de la célula 2.
Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son supuestamente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes a 3. ellos DISPestablecer una tolerancia inherentemente alta contra las amenazas externas: humedad, presión osmótica, el estrés mecánico 4, calor, radiación UV 5, desinfectantes, agentes antimicrobianos, y el sistema inmune del huésped 1. Por ejemplo, la concentración de agente antimicrobiano necesaria requerida para matar un biofilm ha demostrado ser hasta 1.000 veces mayor en comparación con la requerida para matar a las bacterias planctónicas. La explicación de esta mayor tolerancia parece ser multifactorial. La matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa; su transición entre los diferentes estados metabólicos debido a un gradiente existente de oxígeno, nutrientes y metabolitos entre las partes interior y exterior de la biopelícula 6. Por lo tanto, en algunas regiones del biofilm, como el núcleo, las bacterias son privadas de oxígeno y nutrientes y viven en un metabólicamente menos activo o un estado completamente inactivos <sup> 7. Las células completamente inactivos se denominan células como persister, y no son susceptibles a los tratamientos antimicrobianos convencionales 8. Por lo tanto, es probable que la resiliencia biofilm surge de una combinación de los mecanismos actualmente sugeridos y otros, todavía desconocidos,. Staphylococcus spp. siguen estando entre las más problemáticas bacterias gram-positivas, causando graves, a menudo relacionados con la biopelícula, infecciones 4. Se sugiere que hasta el 99% de todas las bacterias están asociadas dentro de los biofilms, por lo que es el estilo de vida bacteriana predominante 3. Sin embargo, todos los antibióticos actualmente existentes se han desarrollado contra bacterias (planctónicas) de una sola célula. Hasta el momento, un repertorio muy limitado de moléculas existe que pueden actuar selectivamente sobre biofilms maduros. Esta situación ha llevado a un cambio de paradigma progresivo en el descubrimiento de fármacos, en la que se ha instado a la búsqueda de anti-biopelículas a ocupar un lugar más prominente.
Desde un METODOLOGÍAical perspectiva, existen retos adicionales, ya que sólo un número limitado de métodos de biopelícula han sido desarrollados por organizaciones de normalización, en especial los aplicables a la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas. Todos los ensayos estandarizados (con una sola excepción) se basan en los reactores de biopelícula, y estos métodos requieren grandes volúmenes de trabajo y grandes cantidades de compuestos a ensayar, que son por lo general no está disponible durante la fase de investigación temprana 9-12. El ensayo de cribado-aplicable estandarizado única existente es el llamado dispositivo de Calgary Biofilm, de la que el sistema disponible en el mercado mínimo biofilm eliminación de concentración (MBEC) se desarrolló 13-15. Sin embargo, la limitación de este ensayo es que los biofilms se cultivan en las clavijas, y no todas las especies bacterianas o incluso cepas de la misma especie son capaces de formar biopelículas en este dispositivo. Además, los métodos que se pueden aplicar en particular a la exploración de compuestos naturales sonnecesario. Los productos naturales han sido la principal fuente de innovación en el descubrimiento de fármacos antimicrobianos en el último siglo 16. Ellos pueden proporcionar nuevos compuestos anti-biopelícula con mecanismos de acción únicos que también pueden ser eficaces contra las células persister. Por lo tanto, la exploración de bibliotecas naturales y naturalmente inspirados tiene grandes posibilidades de producir cables anti-biopelícula prometedores y únicos.
A continuación, presentamos los detalles experimentales de una plataforma de ensayos que fue desarrollado para la detección química de los compuestos anti-biopelículas utilizando tres pruebas para medir los efectos sobre la viabilidad, la biomasa total, y la matriz del biofilm de Staphylococcus aureus. La primera ensayo mide la viabilidad biofilm, y se basa en la tinción resazurina. La resazurina es una mancha redox que es azul y no fluorescente en su estado oxidado y se convierte en resorufina rosa, altamente fluorescente cuando se reduce por la actividad metabólica de las bacterias. Es un m muy simple y rápidoétodo adecuado para pruebas de detección primaria 17-20. El segundo ensayo, basado en la tinción de cristal violeta, mide la masa total de biofilm. El cristal violeta es una mancha muy utilizado para el estudio de las bacterias y las bacterias en las biopelículas 19,21-23. El ensayo se basa en reactivos baratos y tiene un simple lectura de la absorbancia de punto final. Por último, la tercera ensayo se dirige a la -matrix extracelular sustancia polimérica (EPS) de la biopelícula a través de aglutinina de germen de trigo (WGA), que se une específicamente a poli- N -acetil residuos-glucosamina (PNAG) presentes en la matriz de las biopelículas estafilocócicas 24. El WGA está conjugado con un fluoróforo que puede ser detectada mediante lectores de intensidad de fluorescencia 25. Presentamos aquí los razonamientos y detalles de la plataforma que hemos desarrollado, incluyendo ejemplos de aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
No hay ningún método único que puede medir simultáneamente el efecto de un compuesto sobre el, la biomasa, y la matriz de la biopelícula viabilidad. Por lo tanto, hay una necesidad de combinar los ensayos con el fin de detectar un efecto sobre los tres puntos finales, preferiblemente en una etapa de detección primaria.
La resazurina es un protocolo de tinción muy simple que consiste solamente en la adición de la sonda redox. Sin embargo, establecer el tiempo de incubación óptimo de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al profesor Paul Cos y LMPH, Universidad de Amberes, Bélgica, por su apoyo durante el proceso de filmación en su laboratorio. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia proyectos (proyectos 272266 y 282981) y Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. Las contribuciones técnicas de Maestría Janni Kujala son reconocidas.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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