Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Schlaganfall während der Neugeborenenperiode ist eine wesentliche Ursache für Tod und Behinderung, in so viele wie 1 in 2300 Lebendgeburten 1 auftreten. Dies führt zu veränderten Zentralnervensystementwicklung und erhöhte Morbidität langfristige, einschließlich einer erhöhten Inzidenz von Epilepsie, Zerebralparese, geistige Retardierung, und andere Arten von Motor oder kognitiver Dysfunktion. Die lebenslangen Auswirkungen des frühen Schlaganfalls machen translationale Tiermodelle wesentlich für die Mechanismen der Schädigung und Reparatur in dieser Population untersuchen, einschließlich den Strategien für das verletzte Gehirn zu schützen oder Reparatur zu verbessern.
Verschiedene Ischämie Modelle wurden zu studieren Hirnverletzungen bei erwachsenen Tieren verwendet, und während die Reis-Vannucci (Modified Levine) 2 – Verfahren üblicherweise verwendet wird , hypoxischischämischer Verletzungen in das sich entwickelnde Gehirn, fokale Ischämie-Reperfusion ist eine deutliche Mechanismus der Schädigung zu studieren Brenn Verletzungen verursachen, mit einem verletzten Kern und penumbra und unversehrtes entfernt liegendes Gewebe. Die Koizumi 3 und 4 Longa Modelle wurden in erwachsenen Ratten entwickelt , um transiente Okklusion der Arteria cerebri media über die Arteria carotis communis (CCA) und Arteria carotis externa (ECA) zu erreichen, respectively. In beiden Modellen permanent Ligatur und Kauterisation der Arterie Zweige sind wichtige Blutungen zu minimieren und das chirurgische Verfahren zu straffen, die auch negative Auswirkungen auf das Tier die Fähigkeit, nach einer Verletzung zu füttern und zu Gewichtszunahme führt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Verletzungsmechanismen im unreifen Gehirn und spezifische Muster von Verletzungen als Folge gesehen.
Mehr photothrombotic Schlaganfall (Rose-Bengal – Methode) 5 und permanente MCA Ligation 6 wurden zu studieren Neugeborenen und Erwachsenen Schlaganfall vor kurzem verwendet. Sowohl photothrombotic Schlaganfall und MCA Ligation schaffen dauerhafte Veränderungen der Hirndurchblutung, die in einem Mangel an reperfus führenIon. Reperfusion ist eine kritische Komponente der Entwicklung und Progression von fokaler Verletzung, mit erhöhter Exzitotoxizität, die Bildung freier Radikale, und die Produktion von Stickoxide zu verzögerten Zelltod führt , die Kaskaden beinhaltet Signalisierung , die 7 von der ischämischen Phase verschieden sind. Hypoxie-Ischämie beinhaltet permanente Ligatur einseitige Karotis durch globalen Hypoxie gefolgt, die auch beim Menschen von der Ursache für hypoxische-ischämische Verletzung unterscheidet und keine konsistenten fokale Verletzungsmuster verursachen, so dass Untersuchung des verletzten Kerns und Penumbra schwieriger.
Wir haben zuvor eine nicht-hämorrhagische Ischämie-Reperfusion Hubmodell in unreifen Ratten unter Verwendung von transienter Okklusion der Arteria cerebri media (MCAO) 8, 9, 10 beschrieben. Dies ist eine weniger invasive Methode, die Zugriffe und verschliesst die MCA durch die Arteria carotis interna ohne permanenten ligatiauf oder Kauterisation. Dies stellt ein Modell der Verletzung ähnlich die häufigste Ursache für einen Schlaganfall in der perinatalen Periode 11, 12. Dieses Ischämie-Reperfusion-Modell der Schädigung führt zu Schäden an den ipsilateralen Striatum und parieto-temporale Kortex. Dieses Modell der tMCAO ermöglicht auch die Kontrolle über die Schwere der Verletzung durch die Dauer der Okklusion variiert. Die Untersuchung von Signalwegen und histologischen Veränderungen in den verletzten Kern und Penumbra und in der unversehrten ipsilateralen und kontralateralen Gewebe können die Mechanismen der Schädigung und Reparatur im unreifen Gehirn aufzuklären. Diese Studie wird diese wichtige Verletzungsmodell für das sich entwickelnde Gehirn nachweisen.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Erstens ist es wichtig , Normothermie von der Einleitung der Narkose bis zum vollständigen Genesung zu halten, da es Auswirkungen sowohl Hypothermie 17 und Hyperthermie 18 auf dem Fortschreiten der Hirnschädigung in beiden unreifen und reifen Tieren bekannt sind. Zweitens, während das Tier zu sichern und Zurückziehen des Einschnitt, optimale Positionierung Atmung zu überwachen und sicherzustellen, dass die Luftröhre frei von Kompression ist unerlässlich. Drittens vermeiden Quetschen oder die Vagusnerv-Stretching, wie diese Veränderungen der Herzfrequenz mit Vagusstimulierung verursachen kann. Viertens, weil das Zurückziehen des ICA notwendig ist, Blutungen während der Arteriotomie zu steuern, muss die Aufmerksamkeit auf den Grad der Spannung während des Rückzugs bezahlt werden, um die Arterie zu beschädigen. Wenn die Arterie von Rückzug reißt, oder wenn es eine schlechte Arteriotomie Einschnitt ist, sollte das Tier von der Analyse des Risiko aufgrund ausgeschlossen werdenvon Blutungen und schlechter Reperfusion.
Technische Änderungen und Fehlersuche
Mit MRT als Leitfaden kann die Fadenlänge optimiert werden, um sicherzustellen, dass die Silikonspitze richtig die MCA verschliesst die fokale Ischämie zu erstellen. Wenn MRT nicht verfügbar ist, können Welpen vor der Reperfusion eingeschläfert werden für die Präparation der Platzierung der Naht sichtbar zu machen. Stellen Sie die Fadenlänge nach Bedarf. Das Pup Gewicht korreliert stark mit den verschließenden Fadenlänge Anforderungen. Die Okklusionszeit kann modifiziert werden, um den Grad der Verletzungsschwere anzupassen.
Darüber hinaus Nahtform und Länge sind kritisch. Für P10 Sprague-Dawley-Ratten und Long Evans mit einem Gewicht von 19-21 g, beträgt 10 mm die optimale Länge des Einsetzens in unserer Erfahrung. Ein weiteres Einsetzen des verdeckenden Naht kann in der Perforation des MCA führen. Darüber hinaus führt die Konsistenz in der Form des verdeckenden Fadens in jeder Operation in einer erhöhten Konsistenz Verletzungs pattern 19, 20. Aus diesem Grund empfehlen wir professionell hergestellten Nähte für diesen Zweck verwendet wird. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Verletzungsmuster zwischen Praktikern aufgrund scheinbar winziger Unterschiede in Technik unterscheiden.
Einschränkungen der Technik
Die Durchführung dieser Technik in einem kleinen, Nagetier Entwicklung erfordert viel Erfahrung. Wenn es richtig durchgeführt wird, ist der Chirurg in der Lage, ein sehr konsistentes Verletzungsmuster über Tiere verschiedener Größen verursachen und eine Überlebensrate von mehr als 95% zu erreichen. Darüber hinaus sind geeignete chirurgische Instrumente unerlässlich. Chirurgische Instrumente müssen gut gepflegt werden, um sicherzustellen, dass alle Instrumentenspitzen richtig nähern.
Bedeutung dieser Technik in Bezug auf bestehende oder alternative Methoden
Während Hypoxie-Ischämie oder die Reis-Vannucci Modell 2 </sup>, wird am häufigsten hypoxischischämischer Verletzung im sich entwickelnden Gehirn zu studieren verwendet wird, ist es wichtig, dass dieses Modell von tMCAO unterscheidet sich dadurch, dass von HALLO zu beachten Ischämie transienter fokaler ohne globale Hypoxie ist, durch eine Reperfusion Phase folgt, wenn die Hindernis entfernt wird und der Blutfluss wieder hergestellt wird. Dies bewirkt, dass eine konsistente und reproduzierbare Verletzungen und ist klinisch translationale durch eine Verletzung Muster ähnlich dem in Vollzeit Neugeborenen Schlaganfall gesehen verursacht. Dies ermöglicht die Untersuchung von fokalen Verletzungsmustern und Ausgleichsreaktionen in unversehrten Geweben.
Zukünftige Anwendungen nach dieser Technik zu meistern
Dieses Modell ist ähnlich wie die häufigste Ursache von Schlaganfällen bei menschlichen Neugeborenen, eine transiente okklusiven Thrombus , die 11, 21 während der perinatalen Periode auftritt. Die Ätiologie ist nicht ganz klar und ist wahrscheinlich multifaktoriell, aber es ist in den meisten Fällen t vermuteto von Embolien ergeben sich aus der Plazenta vorbei 11. Darüber hinaus Anomalien viele Neugeborene mit vermutetem perinatalem Schlaganfall häufig vorhanden mit späterer Anfallsaktivität oder subtiler fokaler neurologischer Untersuchung 22. Dies macht die Verwendung eines einheitlichen, translationale Verletzungsmodell entscheidende Mechanismen der Schädigung Progression und mögliche therapeutische Strategien zu identifizieren.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |