Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Accidente cerebrovascular durante el período neonatal es una causa importante de muerte y discapacidad, se produce en hasta 1 de cada 2.300 nacidos vivos 1. Esto conduce a la alteración del desarrollo del sistema nervioso central y aumenta la morbilidad a largo plazo, incluyendo el aumento de la incidencia de la epilepsia, retraso mental parálisis cerebral, y otros tipos de motor o la disfunción cognitiva. Los efectos de por vida de un derrame cerebral a principios hacen modelos animales de traslación esencial para el examen de los mecanismos de lesión y reparación en esta población, incluyendo estrategias para proteger el cerebro lesionado o para potenciar la reparación.
Diferentes modelos de isquemia se han utilizado para estudiar la lesión cerebral en los animales adultos, y mientras el arroz-Vannucci (Modificado Levine) 2 procedimiento se utiliza comúnmente para estudiar lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, focal isquemia-reperfusión es un mecanismo distinto de la lesión causando lesiones focales, con un núcleo y penu lesionadambra y el tejido no lesionado remoto. Los modelos Koizumi 3 y 4 Longa se desarrollaron en ratas adultas para lograr oclusión de la arteria cerebral media transitoria a través de la arteria carótida común (CCA) y la arteria carótida externa (ACE), respectivamente. En ambos modelos, la ligadura permanente y cauterización de ramas de la arteria son importantes para minimizar el sangrado y para simplificar el procedimiento quirúrgico, que también causa efectos adversos sobre la capacidad del animal para alimentar y para aumentar de peso después de una lesión. Además, hay mecanismos de lesión distintas en el cerebro inmaduro y los patrones específicos de lesión visto como resultado.
Más recientemente, el accidente cerebrovascular photothrombotic (prueba Rosa Bengala-) 5 y la ligadura de MCA permanente 6 se han utilizado para estudiar derrame cerebral neonatal y adulto. Tanto accidente cerebrovascular photothrombotic y la ligadura de MCA crear cambios permanentes en el flujo sanguíneo cerebral que dan lugar a una falta de reperfusion. La reperfusión es un componente crítico del desarrollo y la progresión de la lesión focal, con un aumento de la excitotoxicidad, formación de radicales libres, y la producción de óxido nítrico que conduce a la célula retardada muerte que implica las cascadas que son distintas de la fase isquémica 7 de señalización. Hipoxiaisquemia implica la ligadura de la carótida unilateral permanente seguido de hipoxia global, que también difiere de la causa del daño hipóxico-isquémica en el ser humano y no causa un patrón de lesión focal constante, por lo que el estudio del núcleo lesionado y penumbra más difícil.
Hemos descrito previamente un modelo de accidente cerebrovascular por isquemia-reperfusión no hemorrágico en la rata inmadura usando oclusión de la arteria cerebral media transitoria (MCAO) 8, 9, 10. Este es un método menos invasivo que accede y ocluye la MCA a través de la arteria carótida interna sin ligati permanenteo cauterización. Esto proporciona un modelo de lesión similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en el período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusión de lesión resulta en daños en el cuerpo estriado ipsilateral y la corteza parieto-temporal. Este modelo de tMCAO también permite el control sobre la gravedad de la lesión mediante la variación de la duración de la oclusión. El examen de las vías de señalización y los cambios histológicos en el núcleo lesionado y penumbra y en el tejido ipsilateral y contralateral ileso puede aclarar aún más los mecanismos de la lesión y la reparación en el cerebro inmaduro. Este estudio demostrará este modelo de lesión importante para el cerebro en desarrollo.
Los pasos críticos en el protocolo
En primer lugar, es importante para mantener la normotermia desde la iniciación de la anestesia hasta la recuperación completa, ya que hay efectos tanto de la hipotermia y la hipertermia 17 18 en la progresión de la lesión cerebral en animales inmaduros y maduros a conocer. En segundo lugar, asegurando al mismo tiempo el animal y retraer la incisión, un posicionamiento óptimo de monitor de respiración y para garantizar que la tráquea está libre de compresión es esencial. En tercer lugar, evitar apretar o estirar el nervio vago, ya que esto puede causar cambios en la frecuencia cardíaca con la estimulación vagal. En cuarto lugar, debido a la retracción de la ICA es necesario para controlar el sangrado durante la arteriotomía, se debe prestar atención al grado de tensión durante la retracción para evitar dañar la arteria. Si la arteria no lágrima de retracción, o si hay una mala incisión arteriotomía, el animal debe ser excluido del análisis debido al riesgode la hemorragia y la mala reperfusión.
Modificaciones y solución de problemas
El uso de MRI como una guía, la longitud de la sutura puede ser optimizada para asegurar que la punta de silicona ocluye correctamente la MCA para crear la isquemia focal. Si la RM no está disponible, las crías pueden ser sacrificados antes de la reperfusión para la disección para visualizar la colocación de la sutura. Ajustar la longitud de sutura según sea necesario. El peso de las crías altamente correlaciona con los requisitos de longitud de oclusión de sutura. El tiempo de oclusión se puede modificar para ajustar el grado de gravedad de la lesión.
Además, la forma de la sutura y la longitud son críticos. Para P10 ratas Sprague-Dawley y Long Evans que pesaban 19-21 g, 10 mm es la longitud óptima de la inserción en nuestra experiencia. Además la inserción de la sutura oclusiva puede resultar en la perforación de la MCA. Además, la consistencia en la forma del filamento de oclusión en cada cirugía resultará en un aumento de la consistencia de la lesión pattern 19, 20. Por esta razón, se recomienda el uso de suturas fabricadas profesionalmente para este propósito específico. También es importante tener en cuenta que el patrón de lesión puede diferir entre los profesionales debido a las diferencias aparentemente hora en la técnica.
Limitaciones de la técnica
La realización de esta técnica en una pequeña, el desarrollo de roedores requiere experiencia significativa. Si se realiza correctamente, el cirujano es capaz de provocar un patrón de lesión muy consistente a través de animales de diferentes tamaños y alcanzar una tasa de supervivencia mayor que 95%. Además, las herramientas quirúrgicas adecuadas son esenciales. Los instrumentos quirúrgicos deben estar bien mantenidos para asegurar que todas las puntas de los instrumentos se aproximan adecuadamente.
Importancia de esta técnica con respecto a los métodos existentes o alternativos
Mientras que la hipoxia-isquemia, o el Rice-Vannucci modelo 2 </sup>, se utiliza más comúnmente para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, es importante tener en cuenta que este modelo de tMCAO es distinta de HI en que existe una isquemia focal transitoria y sin hipoxia global, seguida de una fase de reperfusión cuando el se elimina la obstrucción y el flujo sanguíneo se restaura. Esto causa una lesión más consistente y reproducible y es más clínicamente de traslación haciendo que un patrón de lesión similar a la observada en el ictus neonatal a término. Esto permite el estudio de los patrones de lesiones focales y respuestas compensatorias en el tejido sano.
Las aplicaciones futuras después de dominar esta técnica
Este modelo es similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en los neonatos humanos, un trombo oclusivo transitorio que se produce durante el período perinatal 11, 21. La etiología no está del todo claro y es más probable multifactorial, pero se presume en la mayoría de los casos to ser el resultado de émbolos que pasan de la placenta 11. Además, muchos recién nacidos con accidente cerebrovascular perinatal presunta menudo se presentan con la actividad convulsiva tarde o examen neurológico focal sutiles anormalidades 22. Esto hace que el uso de un modelo de lesión consistente, traslacional para identificar los mecanismos de progresión de lesiones y posibles estrategias terapéuticas cruciales.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |