Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Acidente vascular cerebral durante o período neonatal é uma importante causa de morte e incapacidade, ocorrendo em até 1 em 2.300 nascidos vivos 1. Isto leva ao desenvolvimento do sistema nervoso central alterada e o aumento da morbidade a longo prazo, incluindo o aumento da incidência da epilepsia, da paralisia cerebral, retardo mental cerebral, e outros tipos de motor ou disfunção cognitiva. Os efeitos ao longo da vida de acidente vascular cerebral precoce fazer modelos animais translacionais essencial para examinar os mecanismos de lesão e reparação nesta população, incluindo estratégias para proteger o cérebro ferido ou para melhorar a reparação.
Diferentes modelos de isquemia têm sido utilizados para estudar a lesão cerebral em animais adultos, e enquanto o arroz-Vannucci (modificação Levine) 2 procedimento é comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, focal isquemia-reperfusão é um mecanismo distinto da lesão causando lesão focal, com um núcleo de feridos e Penumbra e tecido remoto ileso. Os Koizumi 3 e 4 Longa modelos foram desenvolvidos em ratos adultos para atingir a oclusão da artéria cerebral média transiente através da artéria carótida comum (ACC) e a artéria carótida externa (ECA), respectivamente. Em ambos os modelos, a ligação permanente e cauterização dos ramos da artéria são importantes para minimizar o sangramento e para agilizar o procedimento cirúrgico, o que também provoca efeitos adversos sobre a capacidade do animal para se alimentar e ganho de peso após a lesão. Por outro lado, existem mecanismos de lesão distintos no cérebro imaturo e padrões específicos de lesão vistos como um resultado.
Mais recentemente, acidente vascular cerebral photothrombotic (método de Rose Bengal-) 5 e permanente ligadura MCA 6 têm sido usados para estudar acidente vascular cerebral neonatal e adulto. Ambos acidente vascular cerebral photothrombotic e MCA ligadura criar alterações permanentes no fluxo sanguíneo cerebral que resultam numa falta de reperfusíon. A reperfusão é um componente crítico no desenvolvimento e progressão da lesão focal, com o aumento da excitotoxicidade, formação de radicais livres, e produção de óxido nítrico, levando à morte celular retardada que envolve a cascata de sinalização que são distintas a partir da fase isquémica 7. Hipóxia-isquemia envolve permanente ligação da carótida unilateral seguido por hipoxia global, que também difere da causa de lesão hipóxico-isquêmica em seres humanos e não causa um padrão de lesão focal consistente, fazer estudo do núcleo ferido e penumbra mais desafiador.
Foi anteriormente descrito um modelo de acidente vascular cerebral isquemia-reperfusão não-hemorrágica no rato imaturo usando a oclusão da artéria cerebral média transiente (MCAO) 8, 9, 10. Este é um método menos invasivo que acede e provoca a oclusão da ACM através da artéria carótida interna sem ligati permanenteon ou cauterização. Isto fornece um modelo de lesão semelhante à causa mais comum de acidente vascular cerebral no período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusão dos resultados de lesão em danos para o corpo estriado ipsilateral e córtex parietal e temporal. Este modelo de tMCAO também permite o controle sobre a gravidade da lesão através da variação da duração da oclusão. O exame das vias de sinalização e alterações histológicas no núcleo lesionado e penumbra e no tecido não lesionado contralateral e ipsilateral pode adicionalmente elucidar os mecanismos de lesão e reparação no cérebro imaturo. Este estudo irá demonstrar este modelo lesão importante para o desenvolvimento cerebral.
passos críticos dentro do protocolo
Em primeiro lugar, é importante para manutenção da temperatura a partir do início da anestesia até à recuperação total, como não são conhecidos os efeitos de ambos hipotermia 17 e hipertermia 18 sobre a progressão da lesão cerebral, tanto em animais imaturos e maduros. Em segundo lugar, ao mesmo tempo garantir o animal e retracção da incisão, o posicionamento ideal para monitorizar a respiração e para assegurar que a traqueia é livre de compressão é essencial. Terceiro, evite espremer ou esticar o nervo vago, pois isso pode causar alterações na frequência cardíaca com a estimulação vagal. Em quarto lugar, porque a retracção da ICA é necessário para controlar a hemorragia durante a arteriotomia, deve ser dada atenção ao grau de tensão durante a retracção para evitar danificar a artéria. Se a artéria se rasgue de retracção, ou se existe um mau incisão arteriotomia, o animal deve ser excluída da análise devido ao riscode hemorragia e pobre reperfusão.
Modificações e solução de problemas
Usando MRI como um guia, o comprimento do fio de sutura pode ser optimizada para garantir que a ponta de silicone oclui adequadamente a MCA para criar a isquemia focal. Se MRI não está disponível, os filhotes podem ser sacrificados antes da reperfusão para dissecação para visualizar a colocação da sutura. Ajustar o comprimento de fio de sutura, conforme necessário. O peso das crias altamente correlacionado com os requisitos de comprimento de sutura de oclus. O tempo de oclusão pode ser modificado para ajustar o grau de severidade da lesão.
Além disso, a forma e comprimento da sutura são críticos. Para P10 ratos Sprague-Dawley e Long Evans pesando 19-21 g, 10 mm é o comprimento óptimo da inserção na nossa experiência. Além disso inserção da sutura de oclus pode resultar na perfuração da MCA. Além disso, a consistência da forma do filamento de oclus em cada cirurgia irá resultar num aumento da consistência da lesão pattern 19, 20. Por este motivo, recomendamos utilizando suturas profissionalmente-fabricados para esse fim específico. Também é importante notar que o padrão de lesão podem diferir entre os profissionais, devido às diferenças aparentemente hora em técnica.
Limitações da técnica
Realizar esta técnica em uma pequena, desenvolvendo roedor requer experiência significativa. Se realizada corretamente, o cirurgião é capaz de causar um padrão de lesão muito consistente entre animais de diferentes tamanhos e atingir uma taxa de sobrevivência superior a 95%. Além disso, ferramentas cirúrgicas adequadas são essenciais. Os instrumentos cirúrgicos devem ser bem conservado para garantir que todas as dicas de instrumentos aproximar corretamente.
Significado desta técnica no que diz respeito aos métodos existentes ou alternativos
Enquanto a hipóxia-isquémia, ou o arroz-Vannucci modelo dois </sup>, é mais comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, é importante notar que este modelo de tMCAO é distinto de HI em que não é a isquemia focal transiente sem hipoxia global, seguido de uma fase de reperfusão, quando o obstrução seja removida e o fluxo sanguíneo é restaurado. Isto provoca uma lesão mais consistente e reprodutível e é mais clinicamente translação, fazendo com que um padrão de lesão similar à observada em acidente vascular cerebral neonatal a termo. Isto permite o estudo de padrões de danos focais e respostas compensadoras em tecido não lesado.
As aplicações futuras Depois de dominar esta técnica
Este modelo é semelhante ao a causa mais comum de acidente vascular cerebral em recém-nascidos humanos, um trombo oclusiva transitória que ocorre durante o período perinatal 11, 21. A etiologia não é totalmente clara e é mais provável multifatorial, mas presume-se, na maioria dos casos tO resultado de êmbolos que passam a partir da placenta 11. Além disso, muitos recém-nascidos com AVC perinatal presume frequentemente presentes com actividade convulsiva ou posterior exame neurológico focal subtil anormalidades 22. Isso faz com que o uso de um modelo de lesão consistente, translacional para identificar mecanismos de progressão de lesões e possíveis estratégias terapêuticas cruciais.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |