מניפולציה של Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) ולישון חולדות ועכברים ידי דיקור
Summary
This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.
Abstract
Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.
Introduction
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית נפוצה אשר התקפים חוזרים להתרחש בכל אורך חיים של המטופל. רוב הישנויות אפילפטי יכול להיות נשלט היטב על ידי תרופות אנטי-אפילפטיות (AEDs). עם זאת, כ -30% מכלל חולי אפילפסיה לפתח עקשן אפילפסיה 1. הגורמים לאפילפסיה לישון הפרעות, אשר יכול להחמיר הישנות נוספת. ראיות מוכיחות כי אפילפסיה עלולה לשבש את השינה בלילה או עלול לגרום 2,3 ישנוניים בשעות יום מוגזמים. המחקרים הקודמים שלנו עוד מצביעי אפילפסיה המתרחשים בשלב צייטגבר (ZT) 0, כלומר, בתחילת תקופת אור האור: המחזור כהה, פוחתת שינה; זו מתווכת על ידי שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH), גורם ההומיאוסטטית. אפילפסיה בבית ZT13 (תחילת התקופה האפלה) משפרת את הביטוי של גורם נוסף ההומיאוסטטית, interleukin-1 (IL-1), אשר מגביר שינה. מקצבי היממה שינה משתנים כאשר אפילפסיה מתרחשת ZT6, באמצע4,5 תקופת האור. מצד השני, בעיות השינה להחמיר עוד יותר את ההתקדמות והישנות של אפילפסיה 6. בהתבסס על הראיות הנ"ל, אנו מנסים לחשוף שיטת טיפול אופטימלית זמנית לשלוט אפילפסיה למנוע הפרעות שינה בחולי אפילפסיה. אנחנו בעבר מצאנו electroacupuncture כי (EA) עם תדר גירוי של 10 הרץ, שבו כמות מסוימת של זרם מועברת לתוך נקודת הדיקור באמצעות מחט נירוסטה, בהצלחה מדכאת electrocorticogram (ECOG) פעילויות אפילפסיה והפרעות שינה הנגרמת אפילפסיה 7 . EA עם תדר גירוי 100 הרץ נוסף מידרדר פעילויות אפילפסיה והפרעות שינה בחולדות 8,9. ניסוי מוצלח זה תלוי בשלושה גורמים: ראשית, במודל חיה אפילפטי ריאלי; ושנית, שיטת הקלטה וניתוח שינה במכרסמים; שלישית, ביצועים מדויקים של דיקור וטיפול הדיוק של נקודות הדיקור locatiלפיירפוקס.
אפילפסיה כבר מסווג לשני סוגים עיקריים: מוקדי אפילפסיה אפילפסיה כללית. אנחנו מעוניינים אפילפסיה של האונה הטמפורלית מוקדי (ייתכנו), אפילפסיה כללית, סטטוס אפילפטיקוס (SE), ואת הישנות של אפילפסיה כללית ספונטנית. לכן, מניפולציות שונות מוחלות ליצור מודלי אפילפסיה מתאימים לניסוי שלנו. כדי להקים מוקדי ייתכנו, מינון נמוך של pilocarpine מנוהל לתוך הגרעין המרכזי הותיר של האמיגדלה (CEA). כדי לאמת את המודל הזה, שש אלקטרודות ECOG מושתלים על חזיתית (F1 & F2), הקודקודית (P1 & P2), ו העורפית (O1 & O2) האונות ומשמאל ההמיספרות ימינה, ושוב שתי אלקטרודות הפניה (R1 & R2) מונחות על המוח הקטן בשתי מחציות המוח. צינורית מדריך microinjection נוסף מושתל בניתוח לתוך שמאל CEA (AP, 2.8 מ"מ מן גבחת; ML, 4.2 מ"מ; DV, 7.8 מ"מ ביחס גבחת). הקואורדינטות מותאמות מן Paxinos ו- Wעכברוש atson אטלס 10. אם מוקדי ייתכנו מושרה בהצלחה, רק ההקלטה מן האלקטרודה על קליפת הקודקודית השמאלית (P1), שנמצא ליד שמאל CEA, צריך לרכוש את ECoGs epileptiform דומיננטי, ללא ECoGs epileptiform משמעותי שנרשם בגין אלקטרודות ECOG אחרים. הזרקה (IP) זריקות של pilocarpine לעכברי לגרום להכליל אפילפסיה SE, אבל זה יכול להיות קטלני. חמש זריקות IP של pentylenetetrazol (PTZ) עם מרווח של יום אחד בין כל הזרקה בהצלחה לגרום לאפילפסיה כללית ספונטנית בעכברים וגם להבטיח את המשך קיומו של עכברים. שתי אלקטרודות חוט ECOG מושתלים לתוך הקורטקסים הקודקודית בעכברים לקבל אותות ECOG וכדי לאמת אפילפסיה חוזרים באופן ספונטני.
Polysomnography (PSG) היא שיטה מקיפה להקליט שינויים פיזיולוגיים המתרחשים בזמן השינה, וזה יכול לסווג שינה באופן אובייקטיבי לשלבים שונים של תנועות עיניים בלתי מהירה (NREM) ו rתנועות עיניים apid שינה (REM). PSG רושמת פרמטרים של תפקודי הגוף, כולל גלי המוח (אלקטרואנצפלוגרם, EEG), תנועות עיניים (electrooculogram, EOG), צלילים שרירי השלד (electromyogram, EMG), קצב לב (רל, ECG), ורמות החמצן בדם ופרמטרים הנשימה. בחולדות, אנחנו מתעדים ECoGs, EMGs, טמפרטורת קליפת מוח, פעילות של תנועה לסווג מדינות ערנות למצב של ערות, שנת NREM, ולישון REM. ניתוח שינה בעכברים מתנהל באמצעות ECoGs, EMGs, ותוצאות הפעילות של תנועה. חולדות בניתוח מושתלים עם שלושה ECOG בורג אלקטרודות ליד חזיתית, הקודקודית, ואת הקורטקס של המוח הקטן הנגדי באמצעות ניתוח stereotaxic. נחישות שלאחר רכישה של מדינות הערנות (ערות, שנת NREM, ולישון REM) מתנהלת על פי הפרמטרים רכשו מן ECoGs, EMG, טמפרטורת מוח, פעילות של תנועה. קריטריונים מפורטים לסיווג התנהגות בעלי החיים בשתי חולדות ועכברים מתוארים tהוא פרוטוקול.
חולדות ועכברים שניהם צריכים להיות מורדם עם מינון נמוך של zoletil (25 מ"ג / ק"ג), המהווה מחצית המינון של הרדמה מנוהל בדרך כלל במהלך ניתוח stereotaxic, לפני ביצוע דיקור ידנית או EA. מינון זה מאפשר חיות להתעורר 30 עד 35 דקות לאחר ההזרקה. כך או דיקור ידני או EA מתבצע בתחילת התקופה החשוכה, עם פרק זמן קבוע של 30 דקות, ולאחר כל חית מטופל ברציפות במשך שבועות עד שלושה ימים. EA זרמי גירוי מועברים לתוך נקודות דיקור בפרט באמצעות מחט מפלדת אלחלד מוכנסת לתוך נקודות הדיקור. זרם גירוי רכבת של פולסים מרובעים biphasic, שבו משך הדופק הוא 150 ms ואת עוצמת הגירוי היא 1 mA. אם מחט יבש משמש דיקור ידני, המחט מוכנסת לתוך נקודות הדיקור היא התעוות 10 פעמים כל 5 דקות. החלק הקשה של דיקור ידני או EA הוא למקם את נקודות הדיקור במכרסמים. location של נקודות דיקור ב חולדות או עכברים דומה המיקום האנטומי שלהם בבני אדם. לדוגמה, נקודות דיקור Fengchi הבילטרליים ממוקמים במרחק של כ -3 מ"מ מקו החציוני האחורי על הצוואר, בין שתי האוזניים, הדומה המיקום האנטומי שלה בבני אדם 11. יתר על כן, נקודות הדיקור עם עכבה נמוכה על העור ניתן אישור נוסף. מניפולציה EA דיקור או אחיזת עיניים אחיזת עיניים הוא הכרחי עבור דיקור או ניסויים EA. דיקור דמה או EA דמה צריך להתבצע בכל נקודת דיקור אי הממוקם סמוך דיקור, כגון בסמוך לבית השחי 12.
כדי בהצלחה לחקור את ההשפעות של דיקור או EA על אפילפסיה והפרעות שינה בעזרת אפילפסיה, מהגורמים הבאים חייבים להיות במקום: במודל חית אפילפטי ריאלי, הניתוח המדויק של ECoGs epileptiform ואת ההישנות של אפילפסיה, שיטה לסווג מדינות ערנות , ואת הביצועים של דיקור או EA המדויקים במכרסמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחירת מודל חית אפילפסיה ריאלית חיונית לכל מטרה ניסיון. אחת המטרות שלנו היא להבהיר את ההשפעות של EA על דיכוי אפילפסיה. EA היא רפואה אלטרנטיבית עשוי להפגין האפקט הטיפולי ב אפילפסיה תועד בספרות הסינית העתיקה. עם זאת, קיים מחסור של ראיות מדעיות כדי להוכיח את זה. כדי לקבוע את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.
Materials
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X. Predictors of sleepiness in epilepsy patients. Sleep. 20 (12), 1105-1110 (1997).
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W. Sleep and epilepsy. Semin Neurol. 22, 321-327 (2002).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at ‘Anmian’ (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
