Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura
Summary
This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.
Abstract
Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.
Introduction
A epilepsia é um distúrbio neurológico comum em que crises recorrentes ocorrer durante toda a vida de um paciente. A maioria das recorrências epilépticas pode ser bem controlada pelas drogas anti-epilépticas (DAE). No entanto, cerca de 30% dos pacientes epilépticos desenvolver um refractário epilepsia. causas da epilepsia distúrbios do sono, que podem agravar ainda mais a reincidência. Evidências demonstram que a epilepsia pode tanto interromper o sono durante a noite ou pode causar excessiva 2,3 sonolência diurna. Os nossos estudos anteriores indicam ainda que a epilepsia ocorre em tempo zeitgeber (ZT) 0, ou seja, o início do período de luz, à luz: ciclo escuro, diminui o sono; esta é mediada pela hormona de libertação de corticotropina (CRH), um factor homeostática. Da epilepsia em ZT13 (o início do período de escuro) aumenta a expressão de um outro factor homeostático, interleucina-1 (IL-1), o que aumenta o sono. Sono ritmos circadianos são alteradas quando a epilepsia ocorre em ZT6, o meio daperíodo de luz 4,5. Por outro lado, os problemas do sono exacerbar ainda mais a progressão e recorrência da epilepsia 6. Com base nas evidências acima, tentamos revelar um método terapêutico ideal para controlar simultaneamente epilepsia e evitar interrupções do sono em pacientes com epilepsia. Anteriormente verificou que electroacupuncture (AE) com uma frequência de estimulação de 10 Hz, em que uma certa quantidade de corrente é fornecido para o ponto de acupunctura por meio de uma agulha de aço inoxidável, com sucesso suprime eletrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia e distúrbios do sono induzida por epilepsia 7 . EA com uma frequência de estimulação de 100 Hz se deteriorar ainda mais as atividades epilépticas e distúrbios do sono em ratos 8,9. Esta experiência bem sucedida depende de três fatores: em primeiro lugar, um modelo animal de epilepsia viável; Em segundo lugar, um método para a gravação e a análise do sono em roedores; e em terceiro lugar, o desempenho preciso da acupuntura e a precisão do locati acupointons.
A epilepsia tem sido classificados em dois tipos principais: epilepsia focal e epilepsia generalizada. Estamos interessados em epilepsia focal lobo temporal (ELT), epilepsia generalizada, estado de mal epiléptico (SE), e a recorrência de epilepsia generalizada espontânea. Portanto, diferentes manipulações são aplicados para criar modelos de epilepsia adequados para nossos experimentos. Para estabelecer TLE focal, uma dose baixa de pilocarpina é administrado para dentro do núcleo central esquerdo da amígdala (CEA). Para verificar este modelo, seis eléctrodos de ECoG são implantados na frontal (F1 & F2), parietal (P1 e P2), e occipital (O1 & O2) lóbulos em ambos os hemisférios esquerdo e direito, e mais dois eléctrodos de referência (R1 & R2) são colocados sobre o cerebelo, em ambos os hemisférios. Uma cânula guia microinjecção adicional é cirurgicamente implantado no lado esquerdo CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7.8 mm em relação ao bregma) relativos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watlas rato atson 10. Se o TLE focal é induzida com sucesso, somente a gravação do eletrodo no córtex parietal esquerda (P1), que fica perto da CeA esquerda, deve adquirir as ECoGs epileptiformes dominantes, sem ECoGs epileptiformes significativos registados a partir dos outros eletrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) de pilocarpina em ratos induzem epilepsia generalizada e SE, mas isto pode ser fatal. Cinco injecções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injecção induzir com sucesso epilepsia generalizada espontânea em ratos e também garantir a sobrevivência dos ratos. Dois eléctrodos de fio de ECoG são implantados no córtex frontal e parietal em ratinhos a receber sinais de ECoG e para verificar a epilepsia espontaneamente recorrentes.
A polissonografia (PSG) é um método abrangente para gravar as mudanças fisiológicas que ocorrem durante o sono, e pode objectivamente classificar sono em diferentes estágios de movimento não rápido dos olhos (NREM) e rAPID movimento dos olhos (REM). PSG registra os parâmetros de funções do corpo, incluindo as ondas cerebrais (eletroencefalograma, EEG), movimentos oculares (eletrooculograma, EOG), tons de músculo esquelético (eletromiografia, EMG), ritmos cardíacos (eletrocardiograma, ECG), e os níveis de oxigênio no sangue e parâmetros respiratórios. Em ratos, registramos ECoGs, EMG, temperatura cortical e atividade locomotora para classificar os estados de vigilância em vigília, o sono NREM e sono REM. análise de sono em ratos é conduzida usando ECoGs, EMGs, e resultados de atividade locomotora. Os ratos são implantados cirurgicamente, com três ECoG parafuso eletrodos no frontal, parietal e córtex cerebelar contralateral por cirurgia estereotáxica. determinação pós-aquisição dos estados de vigilância (vigília, sono NREM e sono REM) é conduzida de acordo com os parâmetros adquiridos a partir dos ECoGs, EMG, a temperatura do cérebro e atividade locomotora. Os critérios detalhados para classificar o comportamento do animal em ambos os ratos e murganhos são descritos em Tele protocolo.
Ambos os ratos e ratinhos necessitam de ser anestesiados com uma dose baixa de Zoletil (25 mg / kg), que é a metade da dose de anestésicos normalmente administrados durante a cirurgia estereotáxica, antes de realizar a acupunctura manual ou EA. Esta dosagem permite que os animais acordar 30 a 35 minutos após a injecção. De qualquer acupuntura manual ou EA é executada no início do período de escuro, com um período de tempo constante de 30 min, e cada animal é consecutivamente tratados durante dois a três dias. Estimulantes correntes EA são entregues num ponto de acupunctura particular através de uma agulha de aço inoxidável que é inserida no ponto de acupunctura. A corrente de estímulo é uma série de impulsos quadrados bifásica, em que a duração do impulso é de 150 ms e a intensidade de estimulação é de 1 mA. Se uma agulha for utilizada para a acupunctura manual, a agulha inserida nos acupontos se contraiu 10 vezes cada 5 min. A parte difícil da acupuntura manual ou EA é localizar os pontos de acupuntura em roedores. o locção dos pontos de acupuntura em ratos ou camundongos é semelhante à sua localização anatômica em seres humanos. Por exemplo, os pontos de acupuntura bilaterais Fengchí estão localizados 3 mm de distância da linha média posterior do pescoço, entre as duas orelhas, que é semelhante à sua localização anatómica em seres humanos 11. Além disso, os pontos de acupuntura com baixa impedância sobre a pele pode ser ainda confirmada. Sham acupuntura ou EA sham manipulação é necessária para acupuntura ou experimentos EA. Acupuntura Sham ou EA simulada deve ser realizado em um não-acupoint localizado perto do ponto de acupuntura, como perto da axila 12.
Para investigar com êxito os efeitos da acupuntura ou EA sobre a epilepsia e perturbações do sono induzida por epilepsia, os seguintes fatores devem estar no local: um modelo viável epiléptico animal, a análise precisa do ECoGs epileptiformes e a recorrência de epilepsia, um método para classificar os estados de vigilância , eo desempenho precisa da acupuntura ou eA em roedores.
Protocol
Representative Results
Discussion
A escolha de um modelo animal de epilepsia viável é essencial para cada finalidade experimental. Um dos nossos objetivos é elucidar os efeitos da EA na supressão de epilepsia. EA é um medicamento alternativo que pode apresentar efeitos terapêuticos na epilepsia e tem sido documentada em literatura antiga chinesa. No entanto, há uma falta de evidência científica para provar isso. Para determinar os efeitos da EA sobre epilepsia, nós nos concentramos principalmente sobre os efeitos da EA sobre a epilepsia focal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.
Materials
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
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