Manipolazione di epilettiforme Electrocorticograms (ECoGs) e sonno in ratti e topi con l'agopuntura
Summary
This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.
Abstract
Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.
Introduction
L'epilessia è un disturbo neurologico comune in cui ricorrenti crisi epilettiche si verificano durante tutto la durata della vita di un paziente. La maggior parte delle recidive epilettiche possono essere ben controllati da farmaci anti-epilettici (DAE). Tuttavia, circa il 30% dei pazienti epilettici sviluppare epilessia refrattaria 1. cause Epilessia disturbi del sonno, che può esacerbare ulteriormente recidiva. L'evidenza dimostra che l'epilessia può o disturbare il sonno di notte o può causare eccessiva sonnolenza diurna 2,3. I nostri studi precedenti indicano inoltre che l'epilessia che si verificano al momento zeitgeber (ZT) 0, vale a dire, l'inizio del periodo di luce nella luce: ciclo di buio, diminuisce il sonno; questo è mediata da ormone di liberazione della corticotropina (CRH), un fattore omeostatico. Epilessia ZT13 (all'inizio del periodo buio) aumenta l'espressione di un altro fattore omeostatico, interleuchina-1 (IL-1), che aumenta il sonno. Sonno ritmi circadiani sono alterati quando si verifica l'epilessia a ZT6, al centro dellaperiodo di luce 4,5. D'altra parte, problemi di sonno aggravano ulteriormente la progressione e la recidiva di epilessia 6. Sulla base delle prove di cui sopra, cerchiamo di rivelare un metodo terapeutico ottimale per controllare contemporaneamente l'epilessia e prevenire interruzioni del sonno nei pazienti con epilessia. Abbiamo precedentemente trovato che elettroagopuntura (EA) con una frequenza di stimolazione 10 Hz, in cui una certa quantità di corrente viene erogata nel acupoint attraverso un ago di acciaio inossidabile, sopprime successo electrocorticogram (ECoG) attività epilettiche e disturbi del sonno epilessia indotta 7 . EA con una frequenza di stimolazione di 100 Hz si deteriora ulteriormente le attività epilettiche e interruzioni del sonno nei ratti 8,9. Questo esperimento di successo dipende da tre fattori: in primo luogo, un modello animale di epilessia fattibile; in secondo luogo, un metodo per la registrazione sonno e analisi roditori; e in terzo luogo, le prestazioni accurata di agopuntura e la precisione del punto terapeutico locations.
L'epilessia è stato classificato in due tipi principali: l'epilessia focale e epilessia generalizzata. Siamo interessati a focale epilessia del lobo temporale (TLE), epilessia generalizzata, stato epilettico (SE), e il ripetersi di epilessia generalizzata spontanea. Pertanto, diverse manipolazioni sono applicati per creare modelli epilettici adatti per i nostri esperimenti. Per stabilire TLE focale, una bassa dose di pilocarpina viene somministrato nel nucleo centrale di sinistra dell'amigdala (CEA). Per verificare questo modello, sei elettrodi ECOG sono impiantati sul frontale (F1 e F2), parietale (P1 e P2), e occipitale (O1 e O2) lobi in entrambe gli emisferi destro e sinistro, e altri due elettrodi di riferimento (R1 & R2) sono disposti sopra il cervelletto in entrambi gli emisferi. Un ulteriore cannula guida microiniezione viene impiantato chirurgicamente nella sinistra CeA (AP, 2,8 mm dal bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7.8 mm rispetto al bregma). Le coordinate sono adattati dal Paxinos e Watson ratto atlante 10. Se la focale TLE è indotta con successo, solo la registrazione dall'elettrodo sulla corteccia parietale sinistra (P1), che è vicino al CeA sinistra, dovrebbero acquisire le ECoGs epilettiformi dominanti, senza significativi ECoGs epilettiformi registrati dagli altri elettrodi ECOG. Intraperitoneale (IP) iniezioni di pilocarpina in ratti indurre generalizzata epilessia e SE, ma questo può essere fatale. Cinque iniezioni IP di pentylenetetrazol (PTZ) con un intervallo di un giorno tra ogni iniezione inducono successo epilessia generalizzata spontanea nei topi e anche garantire la sopravvivenza dei topi. Due elettrodi filo ECOG vengono impiantati nelle frontale e parietale nel topo per ricevere i segnali ECOG e per verificare l'epilessia spontaneamente ricorrenti.
La polisonnografia (PSG) è un metodo completo per registrare i cambiamenti fisiologici che si verificano durante il sonno, e può oggettivamente classificare il sonno in diverse fasi del movimento dei non-rapid eye (NREM) e Rmovimento degli occhi APID (REM) del sonno. PSG registra parametri delle funzioni del corpo, tra cui le onde cerebrali (elettroencefalogramma, EEG), i movimenti oculari (elettrooculogramma, EOG), toni muscolo scheletrico (elettromiografia, EMG), del ritmo cardiaco (elettrocardiogramma, ECG) e livelli di ossigeno nel sangue e parametri respiratori. Nei ratti, registriamo ECoGs, EMG, temperatura corticale, e l'attività locomotoria per classificare gli stati di vigilanza in veglia, sonno non-REM, e il sonno REM. analisi del sonno nei topi viene condotta utilizzando ECoGs, EMG, ed i risultati di attività locomotoria. I ratti sono impiantati chirurgicamente con tre vite ECoG elettrodi al frontale, parietale e corteccia cerebellare controlaterale per radiochirurgia stereotassica. determinazione post-acquisizione degli stati di vigilanza (veglia, sonno non-REM e il sonno REM) è condotta secondo i parametri acquisiti dai ECoGs, EMG, temperatura del cervello e l'attività locomotoria. I criteri dettagliati per classificare il comportamento dell'animale in entrambi i ratti e topi sono descritti in tegli protocollo.
Entrambi i ratti e topi devono essere anestetizzati con una bassa dose di Zoletil (25 mg / kg), che è la metà della dose di anestetici normalmente somministrati durante la chirurgia stereotassica, prima di eseguire l'agopuntura manuale o EA. Questo dosaggio permette animali di svegliarsi da 30 a 35 minuti dopo l'iniezione. Sia l'agopuntura manuale o EA viene eseguita all'inizio del periodo buio, con un periodo costante di tempo di 30 minuti, e ogni animale è consecutivamente trattati per due o tre giorni. Stimulating correnti EA vengono consegnati in un particolare punto terapeutico attraverso un ago di acciaio inossidabile che viene inserito nel punto terapeutico. La corrente di stimolo è un treno di impulsi quadrati bifasici, in cui la durata dell'impulso è di 150 ms e l'intensità di stimolazione è di 1 mA. Se un ago a secco è utilizzato per l'agopuntura manuale, l'ago inserito nei punti terapeutici si contrasse 10 volte ogni 5 minuti. La parte difficile di agopuntura manuale o EA è quello di localizzare i punti terapeutici nei roditori. il loczione di punti terapeutici in ratti o topi è simile alla loro localizzazione anatomica negli esseri umani. Ad esempio, gli agopunti bilaterali Fengchi si trovano 3 mm dalla linea mediana posteriore sul collo, tra le due orecchie, che è simile alla sua posizione anatomica nell'uomo 11. Inoltre, le agopunti con bassa impedenza sulla pelle possono essere ulteriormente confermato. Sham manipolazione agopuntura simulata o EA è necessario per agopuntura o esperimenti EA. Agopuntura sham o sham EA devono essere eseguiti in un non-punto terapeutico situato vicino al punto terapeutico, come ad esempio vicino al cavo ascellare 12.
Per indagare con successo gli effetti dell'agopuntura o EA su epilessia e interruzioni del sonno epilessia indotta, i seguenti fattori devono essere a posto: un modello fattibile epilettica animali, la precisa analisi di ECoGs epilettiformi e la ricorrenza di epilessia, un metodo per classificare gli stati di vigilanza , e le prestazioni accurata di agopuntura o EA nei roditori.
Protocol
Representative Results
Discussion
La scelta di un modello animale di epilessia fattibile è essenziale per ogni scopo sperimentale. Uno dei nostri obiettivi è quello di chiarire gli effetti di EA sulla soppressione epilessia. EA è una medicina alternativa che possono presentare effetti terapeutici in epilessia ed è stato documentato nell'antica letteratura cinese. Tuttavia, vi è una mancanza di prove scientifiche per dimostrarlo. Per determinare gli effetti di EA su epilessia, abbiamo principalmente concentrati sugli effetti della EA in lieve ep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministry of Science and Technology (MOST) grants MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. This manuscript was edited and proofread by Mr. Brian Chang, who has experience revising professional documents.
Materials
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
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