Manipulering av epileptiske Electrocorticograms (ECoGs) og Sov i rotter og mus med akupunktur

Summary

This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.

Abstract

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.

Introduction

Epilepsi er en vanlig nevrologisk lidelse som tilbakevendende anfall gjennom pasientens levetid. De fleste epileptiske tilbakefall kan være godt kontrollert av antiepileptika (AED). Men ca 30% av pasienter med epilepsi utvikle refraktær epilepsi ^en. Epilepsi årsaker søvnforstyrrelser, noe som ytterligere kan forverre gjentakelse. Bevis viser at epilepsi kan enten forstyrre søvnen om natten eller kan føre til overdreven søvnighet på dagtid ^2,3. Våre tidligere studier indikerer videre at epilepsi forekommer på zeitgeber tid (ZT) 0, dvs. i begynnelsen av lyset periode i lys: mørke syklus, minsker søvn; Dette er mediert av kortikotropin-frigivende hormon (CRH), en homeostatisk faktor. Epilepsi ved ZT13 (begynnelsen av den mørke periode) øker ekspresjonen av en annen homeostatisk faktor, interleukin-1 (IL-1), noe som øker søvn. Søvn døgnrytme endres når epilepsi skjer på ZT6, midt pålys periode ^4,5. På den annen side, søvnproblemer ytterligere forverre progresjon og gjentakelse av epilepsi ^6. Basert på det ovennevnte bevis, prøver vi å avsløre en optimal terapeutisk metode for samtidig å kontrollere epilepsi og forebygge søvnforstyrrelser hos epilepsipasienter. Vi har tidligere funnet at elektro (EA) med en 10-Hz stimulering frekvens, i hvilket en viss mengde strøm blir levert inn i acupoint gjennom en rustfritt stål nål, med hell undertrykker electrocorticogram (ECOG) epileptiske aktiviteter og epilepsi-induserte søvnforstyrrelser ⁷ . EA med en 100-Hz stimulering frekvens forverres ytterligere epileptiske aktiviteter og søvnforstyrrelser hos rotter ^8,9. Denne vellykkede eksperimentet avhenger av tre faktorer: For det første, en mulig epileptisk dyremodell; for det andre, en fremgangsmåte for søvn registrering og analyse hos gnagere; og for det tredje, nøyaktig ytelse av akupunktur og nøyaktigheten av acupoint beliggons.

Epilepsi har blitt kategorisert i to hovedtyper: focal epilepsi og generalisert epilepsi. Vi er interessert i samlingstinninglappen epilepsi (TLE), generalisert epilepsi, status epilepticus (SE), og gjentakelse av spontan generalisert epilepsi. Derfor er forskjellige manipulasjoner anvendes til å lage egnede epilepsimodeller for våre eksperimenter. For å etablere fokal TLE, er en lav dose av pilokarpin administrert inn i den venstre sentrale kjerne av amygdala (CEA). For å bekrefte denne modellen, er seks ECOG elektroder implantert på frontpartiet (F1 og F2), parietal (P1 og P2) og occipital (O1 og O2) fliker i både venstre og høyre hjernehalvdel, og ytterligere to referanseelektroder (R1 & R2) er plassert over cerebellum i begge halvkuler. En ekstra mikroinjeksjon guide kanyle implantert i venstre CEA (AP, 2,8 mm fra bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i forhold til bregma). Koordinatene blir tilpasset fra Paxinos og Watson rotte atlas ^10. Hvis fokus TLE er vellykket indusert, bare opptaket fra elektroden på venstre parietal cortex (P1), som er nær venstre CEA, bør skaffe seg de dominerende epileptiske ECoGs, uten vesentlige epileptiske ECoGs registrert fra de andre ECOG elektroder. Intraperitoneal (IP) injeksjoner av pilokarpin i rotter indusere generalisert epilepsi og SE, men dette kan være dødelig. Fem IP-injeksjoner av pentylentetrazol (PTZ) med en en-dagers intervall mellom hver injeksjon med hell indusere spontan generalisert epilepsi hos mus, og også sørge for mus overlevelse. To ledning ECOG elektroder implantert i frontal og parietal cortex i mus for å motta ECOG-signaler og for å verifisere spontant tilbakevendende epilepsi.

Polysomnografi (PSG) er en omfattende metode for å registrere fysiologiske endringer som oppstår under søvn, og det kan objektivt klassifisere søvn inn i ulike stadier av non-rapid eye movement (NREM) og rAPID øyebevegelser (REM) søvn. PSG registrerer parametre av kroppens funksjoner, inkludert hjernen bølger (elektroencefalogram, EEG), øyebevegelser (electrooculogram, EOG), skjelettmuskel toner (elektromyogram, EMG), hjerterytme (elektrokardiogram, EKG), og blod oksygen nivå og luftveis parametere. Hos rotter registrerer vi ECoGs, EMGS, kortikal temperatur og muskelaktivitet for å klassifisere årvåkenhet tilstander i våkenhet, NREM søvn, og REM søvn. Sleep analyse i mus er utført ved ECoGs, EMGS og bevegelsesaktivitet resultater. Rotter er implantert med tre ECOG skru elektroder på frontal, parietal og kontralaterale lillehjernen cortex av stereotaktisk kirurgi. Post-oppkjøpet bestemmelse av årvåkenhet stater (våkenhet, NREM søvn, og REM søvn) er gjennomført i henhold til parametrene ervervet fra ECoGs, EMG, hjernetemperatur og bevegelsesaktivitet. Detaljerte kriterier for kategorisering av dyrets oppførsel i både rotter og mus er beskrevet i than protokollen.

Både rotter og mus må bedøves med en lav dose av zoletil (25 mg / kg), som er halvparten av den dosering av bedøvelse som normalt administreres i løpet av stereotaksisk kirurgi, før utfører manuell akupunktur eller EA. Denne dosen kan dyrene våkne opp 30 til 35 minutter etter injeksjonen. Enten manuell akupunktur eller EA blir utført ved begynnelsen av den mørke perioden, med et konstant tidsrom på 30 min, og hvert dyr blir behandlet etter hverandre i to til tre dager. Stimulerende EA strømmer som leveres til et bestemt acupoint gjennom en rustfritt stål nål som settes inn i acupoint. Den stimulus strøm er et tog av bifasiske firkantede pulser, hvor pulsvarigheten er 150 ms, og stimuleringen intensitet er 1 mA. Hvis en tørr nål brukes for manuell akupunktur, blir satt inn i akupunktene nål rykket 10 ganger hvert 5. min. Den vanskeligste delen av manuell akupunktur eller EA er å lokalisere akupunkturpunkter i gnagere. den locasjon av akupunkturpunkter i rotter eller mus ligner de anatomiske plassering hos mennesker. For eksempel er de bilaterale Fengchi akupunkturpunkter ligger 3 mm fra bakre midtlinjen på halsen, mellom de to ørene, som er lik sin anatomisk plassering hos mennesker ^11. Videre kan akupunktene med lav impedans på huden bli ytterligere bekreftet. Narreakupunktur eller narre EA manipulasjon er nødvendig for akupunktur eller EA eksperimenter. Bør narreakupunktur eller narre EA utføres på en ikke-acupoint ligger nær acupoint, for eksempel i nærheten armhulen ^12.

For å kunne undersøke effekten av akupunktur eller EA om epilepsi og epilepsi-indusert søvn forstyrrelser, må følgende faktorer være på plass: en mulig epileptisk dyremodell, presis analyse av epileptiske ECoGs og gjentakelse av epilepsi, en metode for å klassifisere årvåkenhet tilstander og nøyaktig ytelse av akupunktur eller EA hos gnagere.

Protocol

Alle forsøksprotokoller er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Taiwan University. 1. stereotaxic kirurgi for å implantere ECOG Elektroder, EMG elektroder, Brain Termistor, og Injection guide kanyle For rotter (250-350 g, 6- til 8 uker gamle Sprague-Dawley-rotter) Anesthetize rottene ved IP-injeksjon med 50 mg / kg zoletil. Bekreft riktig dybde av anestesi ved å observere en mangel på respons etter å knipe bakfo…

Representative Results

Det finnes forskjellige rotte- og musemodeller for å tilfredsstille behovene til forskjellige epilepsi typer. Å indusere focal TLE, 0,5 mL av pilokarpin (2,4 mg / mL) administreres i venstre CEA. De dominerende epileptiske ECoGs er ervervet fra ECOG elektrode på parietallappen av venstre hemisfære (Figur 1A: b), og sjeldne epileptiske aktiviteter er plukket opp fra resten av ECOG elektroder (figur 1A: a, c, d…

Discussion

Å velge en mulig epilepsi dyremodell er essensiell for hver eksperimentelle formål. Et av våre mål er å belyse effektene av EA på epilepsi undertrykkelse. EA er en alternativ medisin som kan utvise terapeutisk effekt ved epilepsi og har blitt dokumentert i gamle kinesiske litteratur. Men det er en mangel på vitenskapelig bevis for å bevise det. For å fastslå effekten av EA på epilepsi, vi primært fokusert på effekten av EA på mild fokal epilepsi, snarere enn på alvorlig generalisert anfall eller SE. Vår …

Materials

Drugs
Zoletil	Virbac		50 mg/kg i.p.
pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503	300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection
PTZ	Sigma-Aldrich	P6500	0.035 mg/mouse
polysporin	Pfizer
Surgery
ECoG electrode	Plastics One	E363/20	screw electrode for rats
Pedestal	Plastics One	MS363
Cannula	Plastics One	C315G/spc
Thermistor	Omega Engineering	44008
Dental acrylic	Tempron
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Dural arms
Recording equipments
ECoG amplifier	Colbourn Instruments	V75-01
A/D Board	National Instruments	NI PCI-6033E
Infrared-based motion detectors	Biobserve GmbH	custom-made
ICELUS	G-System
AxoScope 10 Software	Molecular Devices
Acupuncture needs
Stainless needles	Shanghai Yanglong Medical Articles Co.	32 gauge x 1”
Functions Electrical Stimulator	I.T.O., Japan	Trio 300
AcuPen	Lhasa OMS	Pointer Excel II