טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.
מחקרים במעבדה שלנו מחלות myeloproliferative האדם הנגרמת על ידי אונקוגנים כגון Bcr-Abl או גורם הגדילה לקולטן הנגזרות אונקוגנים (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα וכו '). אנו מסוגלים מודל מחקר מחלות אנושיות, כמו במודל העכבר שלנו, על ידי השתלת תאים במח העצם נגוע בעבר עם רטרווירוס ביטוי oncogene של עניין. שכפול-פגום רטרווירוס קידוד oncogene האדם סמן (GFP, RFP, גן עמידות לאנטיביוטיקה, וכו ') מופק על ידי פרוטוקול transfection חולף באמצעות תאים 293T, קו אנושי כליות תא אפיתל ממיר את המוצר adenovirus גן E1A. 293 תאים יש את המאפיין יוצא דופן להיות transfectable מאוד על ידי סידן זרחתי (Capo 4), עם יעילות של עד 50-80% transfection להשגה בקלות. כאן, אנו שיתוף transfect 293 תאים עם וקטור retroviral ביטוי oncogene עניין פלסמיד המבטא את איסור הפרסום-pol-env פונקציות אריזה, כגון הגנום יחיד אריזה בונה קאט או PCL, במקרה זה EcoPak פלסמיד. Transfection הראשונית היא שיפור נוסף על ידי שימוש chloroquine. מניות של הנגיף ecotropic, שנאספו supernatant תרבות 48 שעות. פוסט transfection, ניתן לאחסן -80 ° C ו המשמש זיהום של קווי תאים לאור השינוי במבחנה, או תאים ראשוניים כגון עצם לתאי מוח העכבר, כי לאחר מכן ניתן להשתמש להשתלה במודל העכבר שלנו .
ארבע נקודות קריטיות יבטיח את ההצלחה של מניות ויראלי טוב:
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
2M CaCl2 | Sigma | |||
miliQ H2O | sterile-filtered | |||
Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
6 cm plates | for tissue culture | |||
Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
18G needles | single use, one per virus type. | |||
45 um syringe filters | ||||
5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
50 ml conical tubes | ||||
cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.