Produktion av replikationskompetenta Defekta Retrovirus av övergående transfektion av 293T celler

Summary

Denna teknik visar ett effektivt sätt att förbereda replikering-defekta retrovirus lager kodar en människa onkogen, och därefter används för induktion av myeloproliferativ sjukdom i musmodell.

Abstract

Vår laboratoriestudier mänskliga myeloproliferativa sjukdomar som orsakas av sådan onkogener som Bcr-Abl-eller tillväxtfaktor receptor-derived onkogener (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα etc.). Vi kan modellera och studera en mänsklig-liknande sjukdom i vår musmodell, genom att transplantera benmärgsceller tidigare infekterats med ett retrovirus som uttrycker onkogen av intresse. Replikering-defekt retrovirus kodar en människa onkogen och en markör (GFP, RFP, gen för antibiotikaresistens, etc.) är producerad av en transient transfektion protokoll med 293T celler, en mänsklig nedsatt epitelceller linje förvandlas genom adenovirus E1A genprodukten. 293 celler har den ovanliga egenskapen att vara mycket transfectable av kalciumfosfat (CAPO _4), med upp till 50-80% transfektion effektivitet lätt att uppnå. Här samarbete transfektera vi 293 celler med ett retrovirus vektor som uttrycker onkogen av intresse och en plasmid som uttrycker gag-pol-ENV förpackningar funktioner, såsom den enda-genomet förpackningar konstruktioner kat eller PCL, i detta fall Ecopak plasmiden. Den initiala transfektion förbättras ytterligare med hjälp av klorokin. Lagren av ecotropic virus, som samlats in som supernatant 48 timmar. efter transfektion, kan förvaras vid -80 ° C och används för infektion av cell-linjer på grund av omvandling och in vitro studier, eller primära celler såsom benmärg hos möss celler, som sedan kan användas för transplantation i vår musmodell .

Protocol

Kvällen innan förvandlingen, plåt 293T celler vid 3-5×10 6 celler / 6 cm vävnad cultureplate. Observera: Vi använder 293T celler för sin enkla transfektion och efficacyas virus celler. Dessa celler är brist på förpackningar viruset inte en hjälpare plasmid införs. Den första morgonen, ta försiktigt bort medium och ersätt med 4 ml 293T cell med innehållande 25 mM klorokin. Sätt i inkubator för 1 tim. Observera: plattan bör vara ca 80% konfluenta….

Discussion

Fyra kritiska punkter kommer att försäkra framgång för en bra viral lager:

1. Den 293T celler måste vara mycket frisk, vilket innebär att de har delats upp på ett mycket regelbundet schema, aldrig igen, och är klädd i den optimerade täthet av 3,5 till 5.000.000 per 6 cm vävnadsodling tallrik, så att de når en densitet 80% av plåten på morgonen den transfektion.
   
2. Tillägg av klorokin förbättrar transfektion effektivitet och efterföljande virus titer, ca 3 – till 5-faldig, genom att stabilisera…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.