Scanning Electron Microscopy (SEM) Protokoller for Problematisk Plant, ægsporesvampe, og Fungal Prøver

Summary

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Abstract

Almindelige problemer i behandlingen af ​​biologiske prøver for observationer med scanning elektron mikroskop (SEM) omfatter celle sammenbrud, behandling af prøver fra våde mikromiljøer og celle ødelæggelse. Brug unge blomster væv, ægsporesvampe cyster og svampesporer (BLADHATTE) som eksempler, specifikke protokoller til at behandle sarte prøver er beskrevet her, der kan overvinde nogle af de vigtigste udfordringer i prøve behandling for billedoptagelse under SEM.

Blomster dannelsesvæv fast med FAA (formalin-eddikesyre-Alkohol) og forarbejdet med det kritiske punkt Dryer (CPD) ikke udviser kollapsede cellulære vægge eller forvrænget organer. Disse resultater er afgørende for genopbygningen af ​​blomster udvikling. En lignende CPD-baserede behandling af prøver fra våde mikromiljøer, såsom glutaraldehyd-fikseret ægsporesvampe cyster, er optimalt at teste forskellen vækst af diagnostiske egenskaber (f.eks, cyste pigge) på forskellige typer af substrates. Ødelæggelse af sygeplejerske celler knyttet til svampesporer blev undgået efter rehydrering, dehydrering, og CPD behandling, et vigtigt skridt til yderligere funktionelle studier af disse celler.

Protokollerne beskrevet her repræsenterer lave omkostninger og hurtige alternativer for erhvervelse af god kvalitet billeder til rekonstruere vækstprocesser og studere diagnostiske egenskaber.

Introduction

I biologi, er brugen af scanning elektronmikroskopi (SEM) blevet udvidet til studier af strukturelle udvikling, sammenlignende morfologi, orgel udvikling og karakterisering af populationer eller arter ^1. Med sin todimensionale visning af mikroskopiske strukturer, områder som Mikromorfologisk og systematik profiteret af SEM Teknik fremskridt siden anden halvdel af det 20. ^århundrede. For eksempel indførelsen af katodeforstøvningscoatingssystem metoden i 1970'erne gjort mulige observationer af sarte materialer såsom skyde spidser og blomster øger billeddannelse af ikke-ledende væv ^{2, 3.} SEM bruger elektroner skubbes ud fra overfladen af prøven til at reproducere topografien i en høj-vakuum miljø ^4.

Undersøgelser med SEM er fokuseret i både slutning af strukturelle karakterer og genopbygningen af ​​growth processer. Nye strukturelle tegn relevante for taksonomi og systematik i en bred vifte af organismer er blevet opdaget fra SEM observationer. For eksempel, plante træk bruges for arter, diagnose eller supraspecific klassifikationer, såsom vestured gruber af træ ^_5, stigmatisering mangfoldighed ^6, nectary og blomster morfologi ^{7, 8,} trichome detaljer ⁹ og pollenkorn ^{10, 11,} kan ikke sigtes ordentligt uden SEM. Succesfulde observationer med konventionelle SEM er også opnået for lang tid formalin-fikserede organismer ¹² og plante herbarium prøver ^13.

På den anden side, studier af rekonstruktion af vækst processer ved hjælp af SEM involvere en bred vifte af emner, såsom organudvikling ^14, infeKTIONER fremkaldt af bakterier ^15, plante rod fysiologi ^16, parasit-vært vedhæftede mekanismer ^{17, 18,} narkotika virkninger på parasitter ^19, mycoparasitism og antibiotiske ^{20, 21,} vækst misdannelse ^22, sammenlignende udvikling af vilde og mutant individer ^23, og hele livscyklus ^24. Selvom scanning miljømæssige elektronmikroskoper (ESEM) ²⁵ kan have vigtige fordele til observation af våde biologiske prøver i vækstprocesser, kan delikat materiale stadig blive kompromitteret, selv i lavt vakuum tilstand ESEM), og skal behandles tilstrækkeligt for at undgå tab af værdifulde morfologiske observation.

I dette papir, en gennemgang af specifikke protokoller for SEM-observation af tre different typer prøver præsenteres: blomster meristemer, Oomycetes (Saproleqnia) og svampe materiale. Disse protokoller kompilere oplevelsen af vores tidligere SEM-baserede studier ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} hvor der er fundet særlige vanskeligheder og alternative løsninger. I tilfælde af anlæg sammenlignende udviklingsmæssige og strukturelle studier, brug af SEM startede i 1970'erne ^{34, 35,} og siden da, opdagede forskerne, at visse blomster funktioner er mere labile end tidligere antaget ^36. Rekonstruktion af blomster udvikling indebærer opsamling af alle stadier mellem unge blomster meristemer og anthesis. For at nå dette mål, er det essential at prøven topografi og cellevæggen integritet ikke kompromitteres efter optagelsen og efterfølgende dehydrering. Unge blomster meristem er særligt sårbare over cellevæggen kollaps (figur 1a, 1b). Ligeledes sarte strukturer såsom nectaries, kronblade, stigmata og sporangier kræver effektive og undamaging protokoller. Denne anmeldelse opsummerer en optimal protokol til at holde unge og sarte væv intakt for SEM billeddannelse.

I tilfælde af oomyceter (Stramenopiles) -on af de mest forskelligartede og udbredte grupper af parasitter, med værter lige fra mikrober og planter til invertebrater og vertebrater ³⁷ – der er sporer, der vokser og udvikles i et vådt miljø. Denne betingelse er en udfordring for SEM-observation, fordi sporerne har brug for en tilstrækkelig substrat ikke egnet til standard SEM-protokoller. Blandt Oomycetes, arter af Saproleqnia er af særlig interesse, fordi de can forårsage alvorlige reduktioner i akvakulturer, fiskeri og padder befolkninger ^38. Micromorphological karakteristika, såsom de krogede spines af cyster, har vist sig at være nyttigt at identificere arter af Saproleqnia, som er grundlæggende for at etablere infektion kontrol og potentielle behandlinger ^39. Her er der en forsøgsprotokol for at sammenligne de mønstre af rygsøjlen vækst af cyster på forskellige substrater og til at manipulere prøven til kritiske punkt tørretumbler (CPD) forberedelse og efterfølgende SEM-observation.

I en tredje sag, der er interessante fund, der kom op efter en inspektion af sporer af svampe Phellorinia herculanea f. stellata f. nova (BLADHATTE) ^31. Sammen med de sporer, blev en gruppe af uventede planteskole celler identificeret under SEM. Med tidligere traditionelle protokoller og ubehandlet materiale, kom de sygeplejerske celler out fuldstændig sammen (figur 1c). Yderligere slutninger om særlige væv associeret med sporerne kan fremstilles med de enkle, men vigtige ændringer til standardmetoder beskrevet her (figur 1d).

I denne gennemgang er der detaljerede SEM protokoller, der kan anvendes til at behandle forskellige problemer forbundet med SEM-observation i dækfrøede, Oomycetes, og BLADHATTE, såsom celle sammenbrud og meristemvæv krympning, ikke-optimal vækst af cyster spines, og destruktion af flygtige væv henholdsvis.

Figur 1: Sammenligning af prøver behandlet uden (a, c) og med (b, d) protokollen FAA-ethanol-CPD. (A – b) Blomster knopper af Anacyclus clavatus, mid-udvikling. Bud behandlet med osmiumtetroxid ^{46 <}/ sup> (a) og knop behandlet med FAA-CPD-protokol (b). (C – d) Sygeplejerske celler med sporer af Phellorinia herculanea f. stellata. Tørrede prøver uden nogen behandling (C) og med protokollen her beskrevet for BLADHATTE (d). Sporer i orange. Skalaer: (ab) 100 um, (CD) 50 um. Billeder er taget af Y. Ruiz-León. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol omfatter seks hovedafsnit, tre hengivne til specifikke organismer (afsnit 1-3), og tre, der beskriver de procedurer, der er fælles for alle (4-6). Stjerner (*) indikerer skridt ændret af eksperimentatorer. 1. Undersøgelser af Udvikling og fuldt dannet Plant Structures Indsamling og fiksering Hvis plantematerialet opsamles i et sted uden adgang til et stinkskab, indføre og nedsænke materialet i 70% ethanol i centrifugerør. Ide…

Representative Results

Floral Udvikling og Fiksering af Udvikling og fuldt dannet Plant Structures Brug af FAA-CPD protokollen beskrevet her, er unge og modne plantevæv optimalt fast og dehydreret for SEM billeddannelse. Processer såsom blomster udvikling kan rekonstrueres, fordi topografi og formen af knopper ikke fordrejes af celle faldende (figur 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplekse former med held kan dækkes med et ensartet …

Discussion

Med hensyn til standard SEM-protokoller, de procedurer, der præsenteres her omfatter forholdsvis hurtig, let at følge, og billige metoder. Afhængigt af mængden af ​​prøver og på den lette behandling, tager det fire til fem dage til at erhverve billeder af god kvalitet. Herunder passende forholdsregler til byggevaredirektivet og SEM drift sikkerhed, procedurerne er let at håndtere. Særlig forsigtighed bør tages med formalin og glutaraldehyd (se trin 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Der er visse trin,…

Materials

Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier