Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile gözlemler için biyolojik numunelerin işlem en sık karşılaşılan sorunlardır hücre çökme ıslak mikroçevrelerde ve hücre tahrip örnekler işlemden geçirilmesini içerir. SEM altında fotoğraf çekimi için örnek tedavisinde başlıca zorluklardan bazıları üstesinden burada açıklanmıştır narin örnekleri işlemek için, belirli protokoller genç çiçek dokuları, oomiset kistler ve örnek olarak mantar sporları (Agaricales) kullanma.
FAA ile tespit Çiçek meristemler (Formalin-Alkol-Asetik) ve Kritik Nokta Kurutma (CPD) ile işlenmiş hücresel duvarlar ya da bozuk organları çöktü göstermezse vermedi. Bu sonuçlar çiçek gelişiminin yeniden inşası için büyük önem taşımaktadır. Böyle glutaraldehit sabit oomiset kistleri gibi ıslak mikroçevrelerde, alınan örneklerin benzer bir CPD-temelli tedavi, su farklı türde tanısal özelliklerini diferansiyel büyümesini (örneğin, kist dikenleri) test etmek en uygunudurbstrates. mantar sporları bağlı hemşire hücrelerinin imha rehidrasyon, dehidratasyon ve CPD tedavisi, bu hücrelerin daha fonksiyonel çalışmalar için önemli bir adım sonra kaçınıldı.
Burada ayrıntılı protokoller düşük maliyetli ve büyüme süreçlerini yeniden ve tanı özelliklerini incelemek için iyi kalitede görüntüler elde edilmesi için hızlı alternatifleri temsil etmektedir.
Introduction
Biyolojide, taramalı elektron mikroskobu kullanımı (SEM) yapısal evrimi, karşılaştırmalı morfoloji, organ gelişimi ve nüfus veya türlerin 1 karakterizasyonu çalışmalarına uzatıldı. Mikroskobik yapılar olan iki boyutlu görüntüsü, böyle bir mikromorffolojisinin ve sistematiği olarak alanlar 20. yüzyılın ikinci yarısından itibaren SEM tekniği avans yararlandı. Örneğin, 1970'lerde püskürtmeli kaplama yönteminin tanıtımı olarak iletken olmayan dokularda 2, 3 görüntüleme yükseltmiş gibi sürgün uçları ve çiçekler gibi hassas malzemelerin olası gözlemler yapılmıştır. SEM yüksek vakumlu bir ortamda 4 topografya yeniden oluşturmak için numune yüzeyinden çıkarılır elektronları kullanır.
SEM ile ilgili çalışmalar yapısal karakterlerin çıkarım ve growt yeniden inşası, hem de odaklanmışh süreçleri. Yeni yapısal taksonomi ile ilgili karakterler ve organizmaların geniş bir sistematiği SEM gözlemlerden tespit edilmiştir. Örneğin, bitki özellikleri gibi 10, 11, düzgün olmadan görüntülendi olamaz ahşap 5, stigma çeşitliliği 6, nectary ve çiçek morfolojisi 7, 8, pul detayları 9 ve polen taneleri ve vestured çukurlar olarak, türlerin teşhis veya Türüstü sınıflandırmaları için kullanılan SEM. Geleneksel SEM ile Başarılı gözlemler de uzun süre formalin ile fikse organizmalar 12 için elde edilmiş ve bitki herbaryum 13 numune.
Öte yandan, SEM kullanılarak büyüme süreçlerinin yeniden yapılanma çalışmaları organ gelişimi 14, INFE gibi konularda, geniş bir yelpazede içerirBakterilerin 15, bitki kök fizyolojisi 16, parazit-konak bağlanma mekanizması 17, 18, parazitler 19, mycoparasitism ve antibiosis 20, 21, büyüme malformasyon 22 vahşi ve mutant bireylerin 23 karşılaştırmalı gelişme ve tüm yaşam döngülerini uyuşturucu etkileri tarafından uyarılan seksiyonlar 24. Çevre taramalı elektron mikroskopları (ESEM) 25 büyüme süreçlerinde ıslak biyolojik numunelerin gözlem için önemli avantajlara sahip olsa da, hassas malzeme dahi ESEM) düşük vakum koşullarında tehlikeye ve kaybını önlemek için yeterli işlenmesi gerekir olabilir değerli morfolojik gözlem.
Bu yazıda, üç fark SEM gözlem için özel protokoller bir yorumdaÖrneklerin Erent tip sunulmuştur: floral meristemleri, Oomycetes (Saprolegnia), ve fungal madde. Bu protokoller belirli zorluklar ve alternatif çözümler bulunmuştur önceki SEM temelli çalışmalar 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, deneyimi derlemek. Bitki karşılaştırmalı gelişimsel ve yapısal çalışmaların durumunda, SEM kullanımı 1970'li yıllarda 34, 35 yılında başlayan ve o zamandan beri, araştırmacılar belirli çiçek özellikleri, daha önce 36 düşünüldüğünden daha dayanıksız olduğunu keşfetti. çiçek gelişme İmar genç çiçek meristemler ve anthesis'e arasındaki tüm aşamaların yakalama içerir. Bu amaca ulaşmak için, esse olduğunuÖrnek topografya ve hücre duvarı bütünlüğü fiksasyonu ve sonraki dehidratasyon sonra tehlikeye olmadığını ntial. Genç çiçek meristemler hücre duvarı çöküşüne özellikle savunmasız (Şekil 1a, 1b). Benzer şekilde, nectaries, yaprakları, püskülü ve Sporangium gibi hassas yapıların etkin ve undamaging protokolleri gerektirir. Bu yorum SEM görüntüleme için sağlam genç ve narin dokuları tutmak için optimal bir protokol özetlemektedir.
Mikroplar ve bitkilerden omurgasızlar ve omurgalıların 37 arasında değişen ana Omycetes (Stramenopiles'e) parazitlerin en farklı ve yaygın grupların olduğunuz kişiye durumunda – büyümek ve ıslak ortamda gelişebilir sporlar vardır. sporlar, standart SEM protokoller için uygun değildir yeterli alt tabaka gerektiğinden bu durum SEM gözlem için bir sorun teşkil etmektedir. Omycetes arasında Saprolegnia türleri özel ilgi onlar ca, çünkün su kültürlerinde, balıkçılık ve amfibi nüfus 38 ciddi azalmalar neden olur. Bu tür kistler çengel dikenler olarak mikromorfolojik özellikleri, enfeksiyon kontrolleri ve potansiyel tedaviler 39 kurmak esastır Saprolegnia, türlerini belirlemek için yararlı olduğu tespit edilmiştir. Burada, farklı yüzeylerde kistlerin omurga büyümesinin kalıplarını karşılaştırmak ve kritik nokta kurutma (CPD) hazırlanması ve daha sonraki SEM gözlem için örnek işlemek için bir deneysel protokol var.
Üçüncü durumda, mantarlar Phellorinia Herculanea f sporların bir incelemeden sonra geldi ilginç bulgular vardır. stellata f. nova (Agaricales) 31. Birlikte sporlarla, beklenmedik kreş hücrelerinin bir grup SEM altında tespit edilmiştir. önceki geleneksel protokoller ve işlenmemiş malzeme ile, hemşire hücreleri ou geldit tamamen (Şekil 1c) çöktü. Sporların ilişkili belirli dokular hakkında ayrıntılı çıkarımlarda burada açıklanan (Şekil 1d) standart yaklaşımlara basit ama önemli değişiklikler yapılabilir.
Bu derlemede, SEM gözlem ile ilgili farklı sorunlarla başa çıkmak için kullanılabilecek ayrıntılı SEM protokolleri vardır angiospermleri, bu tür hücre çöküşü ve meristematik doku daralması, kist dikenler optimum olmayan büyüme ve imha olarak Oomycetes ve Agaricales, sırasıyla geçici dokular.
Şekil 1: (A, C) ve (B, D) protokolü FAA-etanol-CPD olmadan muamele edilmiş numunelerin karşılaştırılması. (A – b) anacyclus clavatus, orta gelişme Çiçek tomurcukları. Tomurcuk ozmiyum tetroksit 46 <ile işlemden geçirildi/ sup> (a) ve FAA-CPD protokolü (B) ile muamele evlat. (C – d) Phellorinia Herculanea f sporlarla Hemşire hücreleri. stellata. Herhangi bir işleme (C) 'olmayan burada Agaricales'e (d) için tarif edilen protokol ile örnekleri kurutulmuştur. turuncu sporlar. Ölçekler: (ab) 100 mikron (cd) 50 mikron. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standart SEM protokollere göre, burada sunulan prosedürler nispeten hızlı takip edilmesi kolay ve düşük maliyetli metodolojileri içerir. Numunelerin miktarı ve işleme kolaylığı bağlı olarak, kaliteli görüntüler elde etmek için dört-beş gün sürer. CPD ve SEM çalışması için yeterli güvenlik önlemleri de dahil olmak üzere, prosedürler ele kolaydır. Özellikle dikkat (1.1.3 ve protokolün 2.1.5 adımları 1.1.1 bakınız) formalin ve glutaraldehid ile alınmalıdır. Örnekleri zarar veya ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje hibe sözleşmesi No. Bu yayın sadece yazarın görüşlerini yansıtmaktadır 634429. kapsamında Avrupa Birliği Ufku 2020 araştırma ve yenilik programı fon aldı ve Avrupa Komisyonu bilgilerin herhangi bir şekilde kullanımından sorumlu tutulamaz burada yer alan. Biz de gerçek Jardín Botánico, CSIC tarafından yapılan mali katkı kabul. SR Saprolegnia onun araştırma desteği için Avrupa Birliği [ITN-SAPRO-238550] minnettardır. Biz de nazik için Francisco Calonge teşekkür numuneleri (Şekil 5) işlemek için Phellorinia Herculanea görüntüleri ve B. Pueyo sağlamak istiyoruz. Tüm görüntüler Madrid Real Jardín Botánico-CSIC SEM hizmeti tarafından alınmıştır.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
