Сканирующей электронной микроскопии (SEM) Протоколы для Проблемной завода, оомицет и грибковые Образцы
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
Общие проблемы при обработке биологических образцов для наблюдений с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), включают коллапс клеток, обработка образцов из влажных микросреды и разрушение клеток. Использование молодых цветочных тканей, оомицет цисты, и спор грибов (Agaricales) в качестве примеров, конкретные протоколы для обработки тонких образцов, описанных здесь, которые необходимо преодолеть некоторые из основных проблем в лечении образца для захвата изображения при SEM.
Цветочные меристемы, скрепленные FAA (формалин-уксусный-спирт) и обрабатывается с точкой сушильную Critical (CPD) не проявляла разрушилась клеточные стенки или искаженное органы. Эти результаты имеют решающее значение для реконструкции цветочного развития. Подобная CPD-основанная обработка образцов из влажных микросреды, таких как глутаральдегида фиксированные оомицет кист, является оптимальным для проверки дифференциального роста диагностических характеристик (например, киста) шипами на различных типах суbstrates. Уничтожение трофоцитов прикрепленных к спор грибов удалось избежать после регидратации, обезвоживания и лечения CPD, что является важным шагом для дальнейшего функциональных исследований этих клеток.
Подробно изложенные здесь протоколы представляют собой недорогие и быстрые альтернативы для приобретения качественных изображений, чтобы восстановить процессы роста и изучения диагностических характеристик.
Introduction
В биологии, использование сканирующей электронной микроскопии (SEM) была распространена на изучение структурной эволюции, сравнительной морфологии, развития органов, а также характеристика популяций или видов 1. Благодаря двухмерном виде микроскопических структур, таких областях, как микроморфологией и систематики прибыль от SEM техники достижений , начиная со второй половины 20 – го века. Например, введение методики покрыти распылением в 1970 – е годы стало возможным наблюдения деликатных материалов , таких как стрелять верхушках и цветов путем более широкого томографию непроводящих тканей 2, 3. СЭМ использует электронов , выбитых с поверхности образца , чтобы воспроизвести топографию в высоковакуумной среде 4.
Исследования с участием SEM сосредоточены как на выводе структурных персонажей и реконструкции growtч процессы. Новые структурные символы, имеющие отношение к систематике и систематика широкого спектра организмов были обнаружены из наблюдений SEM. Например, растительные признаки используются для видовой диагностики или надвидовых классификаций, таких , как одетый ямах древесины 5, клеймо разнообразия 6, нектарники и цветочные морфологии 7, 8, детали трихому 9 и пыльцевые зерна 10, 11, не может быть правильно визуализированных без SEM. Успешные наблюдения с обычными SEM были также достигнуты для длительного времени фиксированных формалином организмов 12 и растений гербарий образцов 13.
С другой стороны, исследования реконструкции процессов роста с использованием сканирующего электронного микроскопа включают широкий круг вопросов, таких как развитие органа 14, инфеctions , вызванные бактериями 15, растений корневой физиологии 16, механизмы крепления паразит-хозяин 17, 18, воздействие препарата на паразитов 19, mycoparasitism и антибиоз 20, 21, мальформации рост 22, сравнительное развитие диких и мутантных особей 23, и целые жизненные циклы 24. Несмотря на то, экологические сканирующие электронные микроскопы (ESEM) 25 может иметь важные преимущества для наблюдения влажных биологических образцов в процессах роста, тонкий материал все еще может быть поставлена под угрозу , даже в низком вакууме состояния ESEM), и должны быть обработаны надлежащим образом, чтобы избежать потери ценного морфологическое наблюдение.
В этой статье, обзор конкретных протоколов для SEM наблюдения трех Diffразличны типы образцов представлены: цветочные меристемы, оомицетами (сапролегния) и грибковые материал. Эти протоколы компилировать опыт наших предыдущих исследований SEM на основе 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, где были обнаружены специфические трудности и альтернативные решения. В случае растений сравнительного опытно -конструкторских и структурных исследований, использование SEM началось в 1970 – е годы 34, 35, и с тех пор, исследователи обнаружили , что некоторые цветочные особенности более лабильны , чем считалось ранее 36. Реконструкция цветочного развития предполагает захват всех стадий между молодыми цветочными меристем и опыления. Для достижения этой цели, это еззеntial что образец топография и целостность клеточной стенки не поставить под угрозу после фиксации и последующего обезвоживания. Молодые цветочные меристемы особенно уязвимы для распада клеточной стенки (рис 1a, 1b). Кроме того, тонкие структуры, такие как нектарниками, лепестки, рыльца и спорангиев требуют эффективных и undamaging протоколов. В настоящем обзоре обобщены оптимальный протокол, чтобы держать молодых и деликатных тканей нетронутыми для визуализации SEM.
В случае оомицетов (Stramenopiles) -она из самых разнообразных и широко распространенных групп паразитов, с хостами , начиная от микробов и растений беспозвоночных и позвоночных животных 37 – Есть споры , которые растут и развиваются во влажной среде. Это условие представляет собой сложную задачу для наблюдения SEM, поскольку споры нуждаются в адекватной субстрат не подходит для стандартных протоколов SEM. Среди оомицетов, виды Saprolegnia представляют особый интерес , потому что они чап вызвать сильное сокращение аквакультур, рыбными и популяции земноводных 38. Микроморфологические характеристики, такие как крючковатыми колючками кист, были признаны полезными для идентификации видов Saprolegnia, что имеет основополагающее значение для установления контроля за инфекцией и возможные методы лечения 39. Здесь есть экспериментальный протокол для сравнения закономерности роста позвоночника кист на различных подложках и манипулировать образец для критической точки сушилки (CPD) подготовки и последующего наблюдения SEM.
В третьем случае, есть интересные находки , которые пришли после осмотра спорами грибов Phellorinia herculanea ф. Stellata ф. Нова (Agaricales) 31. Вместе со спорами, группа неожиданных детских клеток была определена в соответствии с SEM. С предыдущими традиционными протоколами и необработанного материала, кормилицы клетки пришли НУт полностью развалилась (рис 1в). Дальнейшие выводы о конкретных тканях , связанных с спор может быть сделано с простыми , но важных изменений в стандартных подходов , описанных здесь (рис 1d).
В данном обзоре, существуют подробные SEM протоколы, которые могут быть использованы для решения различных проблем, связанных с наблюдением SEM в покрытосеменные, оомицеты и Agaricales, такие как коллапсу клеток и сокращение меристемы ткани, неоптимального роста киста шипов, и разрушения эфемерные ткани, соответственно.
Рисунок 1: Сравнение образцов , обработанных без (а, с) и с (б, г) протокола FAA-этанол-CPD. (А – б) Цветочные почки Anacyclus clavatus, среднего развития. Bud обрабатывали осмия 46 </ SUP> (а) и Бутон обрабатывают с протоколом FAA-CPD (б). (C – d) трофоцитов спорами Phellorinia herculanea ф. Stellata. Высушенные образцы без обработки (с) и с протоколом здесь описано для Agaricales (г). Spores в оранжевый цвет. Весы: (AB) 100 мкм, (кд) 50 мкм. Фотографии были сделаны Y. Руис-Леон. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Что касается стандартных протоколов SEM, процедуры, представленные здесь, включают в себя относительно быстро, легко следовать, и методологии недорогих. В зависимости от количества образцов и легкость обработки, это занимает от четырех до пяти дней, чтобы получить хорошее качество изоб?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект получил финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Горизонт-2020 в рамках гранта соглашения № 634429. Данная публикация отражает только точку зрения автора, и Европейская комиссия не может нести ответственность за любое использование, которое может быть изготовлен из информации содержащиеся в нем. Мы также признаем, финансовый вклад, внесенный Real Ботанические, CSIC. SR благодарит Европейский Союз [ОИС-Sapro-238550] для поддержки своих исследований в Saprolegnia. Мы также хотим поблагодарить Francisco Calonge за любезно предоставить herculanea изображения Phellorinia и B. Pueyo для обработки образцов (рисунок 5). Все снимки были сделаны с помощью службы SEM на Real Ботанические-CSIC в Мадриде.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
