Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. 1 y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 – 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos 4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando.
La expresión de los receptores GABA A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio 5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente 7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA A, 10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio 13 tripanosoma 14, y un transportador de myo -inositol 15, 16.
Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.
Introduction
Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 – 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales.
Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana .
El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios 17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales 7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos.
Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente 7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h 8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
