一种快速，为隔离，功能可扩展的研究方法，以及细胞衍生的细胞外基质的分析

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

在过去的几十年中，细胞外基质（ECM）已成为公认的是参与多种细胞生理和病理过程多样化，动态和复杂的环境。在组织水平，则ECM影响细胞信号传导，运动，分化，血管生成，干细胞生物学，肿瘤，纤维化等 ^1,2-。 ECM组织和ECM依赖过程的研究因而对细胞生物学和生理学组织广泛的影响。到达细胞外基质组合物，组织和功能性质的一种机械的理解，需要用于ECM的准确分离方法。而从组织³在隔离依靠细胞外基质蛋白的鉴定最早，ECM从培养细胞的准备现已成为更为普遍。

细胞来源的ECM的分离和分析是复杂主要有两个原因。首先，细胞的存在和IR丰富细胞内蛋白质可能使得难以给ECM分离为离散的细胞外结构。事实上，一些ECM蛋白具有在细胞内以及在ECM ⁴的作用;因此，从细胞来源的ECM的有效去除胞内蛋白质是至关重要的，如果蛋白质的ECM内的研究是不与在细胞内的角色混淆。其次，细胞来源的ECM是由许多大，寡聚蛋白质，这往往是共价交联后的ECM组件，因此在标准的洗涤剂不溶性的。这些属性可以变得复杂提取和ECM的进一步分析。为了解决这些问题，需要一种方法，可实现从细胞成分ECM蛋白的有效的分离。

几种方法已在文献中的ECM无论从细胞培养物或组织提取物的分离进行了描述。许多这些方法都瞄准了丰富的ECM PR的提取otein，胶原蛋白，从组织和包括使用中性盐^3，在酸性条件^5,6，或胃蛋白酶^7。从组织提取总细胞外基质的隔离通常涉及的组织的脱细胞的ECM的隔离之前。例如，一个连续提取方法已经描述了分离自人心脏组织⁸的ECM。首先，松散结合的ECM蛋白用0.5M NaCl的前十二烷基硫酸钠（SDS）萃取用来除去细胞。最后，使用4M的胍⁸提取剩余的ECM蛋白质。 ECM还可以从使用8M脲⁹脱细胞的样品溶解。其它技术用洗涤剂，如脱氧胆酸^10，通过离心从可溶细胞裂解物中分离不溶性ECM蛋白前提取两个小区和ECM。

分离和本报告中所述的细胞来源的ECM的分析的方法提供了摄制除去细胞材料，留下可以通过原位免疫荧光进行分析或用于进一步的生化分析中提取细胞源ECM诱导型方法。这种方法可以适用于任何贴壁细胞类型，并且可以按比例增加下游过程，例如免疫印迹或质谱法，或用于功能研究的分离的细胞外基质的利用率。该方法也可以在用活细胞的共聚焦显微镜一起使用，以跟踪的实时感兴趣的标签的蛋白的ECM的沉积。这是通过使用一网格，玻璃底皿而实现的。总体而言，该方法提供了细胞来源的ECM和也以确定并监控该沉积和单个ECM蛋白的动力学范围的精确隔离。

Protocol

1.去除细胞与氢氧化铵溶液通过在适当的密度电镀准备贴壁细胞。 注：细胞可以是用于分析产生足够的ECM任何贴壁细胞类型。在这里，我们描述了使用COS-7细胞，它包含SV-40病毒DNA序列的非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系的; RCS，大鼠软骨肉瘤细胞系;或正常人真皮成纤维（HDF）从幼年包皮菌株。 HDF用于从通道1到唯一通道8。 板上盖玻片活细胞和ECM，对固定的ECM的荧光显微镜研究的摄像单元，或用于制备细胞衍生的ECM的小规模功能测定。板上进行SDS-PAGE分析，免疫印迹，或蛋白质组学研究细胞培养皿的细胞。 注：细胞培养条件（细胞板和培养基的数目）将取决于细胞类型。细胞数量板需要根据经验为特定细胞系或细胞株建立。 允许一个适当的时间，将细胞沉积的ECM，通常> 16小时。注：时间段将取决于细胞类型，将需要根据经验确定。如果导电异位表达时，允许合适时间感兴趣的转染蛋白的表达和细胞外基质的沉积。 在一个排油烟机，准备的20mM氢氧化铵在合适的容器通过与去离子H 2 O稀释该储备溶液1/14 从孵化器中取出细胞，并轻轻取出培养基。通过对盘的壁轻轻倒出不含Ca 2+ / Mg 2+离子添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）。岩盘两次并用塑料移液管除去液体。重复两次。 在排油烟机，倾斜每一道菜，然后从步骤1.2用塑料移液管取出PBS。添加3每100毫米培养皿氢氧化铵中的溶液，并培育它们在室温下5分钟。在5分钟温育期，轻轻搅动菜每分钟，以确保所有的细胞的裂解。步骤1.4-1.7还将在排油烟机进行。 注：替代细胞去除试剂包括2 M或8M尿素，这是与细胞10分钟孵育。 丰富的金额去离子H 2的O添加到每一道菜，每100毫米的菜至少20毫升，用摇摆。氢氧化物溶解的材料，它由氢氧化铵，裂解的细胞，以及去离子H 2 O型通过用移液管抽吸处置铵。转让本废液转化为液体废物的容器。 在丰富的去离子H 2Ø四次洗不溶性ECM层，以确保彻底清除所有的氢氧化铵，溶解的材料。 对于通过免疫荧光ECM的检查，加入2％的固定ECM多聚甲醛（PFA;每100mm培养皿3mL）中在室温下10分钟。 注意：PFA是皮肤或眼睛接触和严重的过度曝光会产生肺部损伤，窒息，昏迷，甚至死亡的情况非常危险。它应该只在排油烟处理，和个人防护装备应戴。 用PBS洗每个固定的样品两次，如在步骤1.2和PFA溶液到合适的液体废物容器的处理。如果需要的话，他们准备荧光显微镜之前在4℃下储存在PBS中的细胞外基质的样品。 2.一个ECM蛋白沉积跟踪由活细胞的共聚焦显微镜成像计数血球下细胞。对于COS-7细胞，板250,000细胞上转染60毫米的细胞培养皿。 注：对于活细胞成像，细胞必须与编码感兴趣的ECM蛋白，在框内融合与遗传编码发出荧光的载体转染的NT标记。这是为了使所关注的细胞外基质蛋白的过程中活细胞成像的鉴定。 后的适当时间用于蛋白质表达（ 例如，16小时），从用胰蛋白酶-EDTA溶液皿除去细胞，用血细胞计数器计数它们，并且板〜150,000个细胞到用于成像的35毫米网格，玻璃底皿。允许对电池2小时，以重新连接，并开始ECM沉积（的时间段将取决于细胞类型和必须凭经验建立）。 注意：使用不含有酚红，因为这可以得到红色色调影响图像质量的细胞培养基。 在上述2小时内，设立了共聚焦显微镜用37℃培养箱室和CO 2的供应。允许在腔室和在盘的温度稳定至成像之前37℃;这可能需要1小时。 孵育镀到网格碟30分钟的荧光细胞标记35毫米的细胞。然后，洗涤​​细胞在成像之前无酚红培养基中两次。 注：细胞质的荧光标记物可以用于可视化细胞卷或膜掺入标记物可以用于可视化小区边缘。 使用20X物镜和相衬的共聚焦显微镜，标识包含了一些（> 3）贴的，健康的细胞适当的方格。确认所选择的靶蛋白在使用63X或100X的目标和在荧光显微镜下的相应波长的选择的网格内的细胞中的表达。 使用Z-栈软件设置荧光和相衬时间推移成像。将“开始”堆栈仅仅是个ECM层和“结束”堆栈下面是公正细胞体的上方。取决于细胞类型设置的z步长到0.3微米，在z体积为5和10微米之间的深度在总。这将每个时间点15-30 Z-部分之间给。 Capturë荧光（红色荧光蛋白（RFP），激发= 555 nm，发射= 584纳米）和相位对比图像周期性超过设定的时间段。例如，使用时间推移软件设置在2分钟的时间间隔，持续时间为2小时。选择“开始”按钮在定义的时间段，开始z轴部的图像的捕获。 在时间周期结束时，从盘除去细胞，如在步骤1.1-1.5中所述，以确认在ECM感兴趣的荧光标记蛋白的定位。 使用相衬成像和20X客观搬迁相关的方格。 切换到63X物镜和荧光显微镜下识别的ECM层。这一形象比较提取前映像 3.细胞来源的ECM的无菌制剂的细胞功能测定盖玻片上，另一珀普生长细胞的一个群体（“黑客帝国生产者”细胞）特征研在至少24小时100毫米细胞培养皿（“测试”细胞）在标准培养。 注意：这些可以是任何两个不同的贴壁细胞类型，实验设计可以包括一种或两种细胞群的转染以表达荧光标记的ECM蛋白。 在层流罩，作为用于细胞培养，制备PBS中的无菌溶液不含Ca 2+ / Mg 2+离子 ，20mM的氢氧化铵通过使每通过无菌0.2（参见步骤1.3），和去离子H 2ö微米的过滤器到一个合适的无菌容器中。 保持无菌技术，轻轻三次用无菌PBS（见步骤1.2）洗盖玻片上的“矩阵制片人”的细胞。 通过抽吸用无菌移液管除去PBS中并在合适的液体废物容器处理它。添加20毫摩尔氢氧无菌铵（3毫升/ 100mm皿）中，用在间隔摇动孵育他们5分钟。 添加丰富的金额无菌去离子H型2 O的“矩阵生产者”菜，每100mm培养皿至少20毫升，用摇摆，并倒掉细胞裂解物到合适的废物容器中。 重复步骤3.5四次，以确保完全除去氢氧化铵溶解的材料制成。 注：盖玻片存放于“矩阵生产者”细胞ECM然后提供与任何感兴趣的测试细胞功能检测无菌ECM。 孵育从细胞库存培养皿试验细胞用1.5毫升的每100mm培养皿胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05％w / v的胰蛋白酶和0.02％w / v的EDTA中Hank氏平衡盐溶液），直到测试细胞从培养皿分离的。添加细胞培养基，在400 XG 5分钟离心试验细胞，除去上层液体。 重悬测试细胞在新鲜，无菌的培养基并用血细胞计数器计数。板，这些测试单元的适当数量到上coversli无菌的，孤立的ECMPS。培养他们在适当的细胞培养基中进行2-3小时，或用于为实验设计所需的时间周期。 为了检查细胞骨架的组织，固定在测试细胞中的2％的PFA和异硫氰酸荧光素染色它们（FITC）-phalloidin（激发= 490 nm，发射= 525纳米）来可视化F-肌动蛋白并用4'，6 -diamidino基-2-苯基吲哚（DAPI;激发= 358 nm，发射= 461纳米）以可视化的核11。 注：比较在铺于异源细胞来源的ECM与镀上自己的ECM测试细胞的试验细胞的形态和肌动蛋白的组织。 4.分离的ECM的用于SDS-PAGE，免疫印迹分析，或蛋白质组学成长100 MM细胞培养皿（5至10道菜蛋白质组学或1-2菜肴免疫）利息贴壁细胞24-96小时，为适合的细胞类型，允许分泌和ECM沉积。 除去细胞作为DESCRIBED步骤1.1-1.5。 倾斜每块板以一定的角度2 O排出残留轰到培养皿底部，并小心地取出任何剩余的H 2 O运用P200的吸管，直到板完全干燥。 平行地，含热的SDS-PAGE样品缓冲液的100mM二硫苏糖醇（DTT）至95℃使用热块2分钟，然后将其添加到板。每100mm板样品缓冲液200微升适合于通过免疫印迹进行检测的样本。 分析通过质谱法的ECM，由从盘收集的SDS-PAGE样品缓冲液（如在步骤4.5和4.6，如下所述）实现更浓缩的样品，将其重新加热至95℃，并在使用相同的等分试样额外的2-3片。 使用细胞刮彻底刮除ECM关闭的菜，确保菜的所有区域都被擦。 用细胞刮刀，收集样品到培养皿的一侧，并用200移除μL枪头，成筒。 传送从细胞刮刀尖端的任何残余的SDS-PAGE样品缓冲液提取到管以减少的ECM材料的损失。对于浓缩的样品，再热同的SDS-PAGE样品缓冲液等分试样到95℃，并在整个额外2-3板重新使用它。 解决通过SDS-PAGE 12，即使用7％或4-7％的梯度聚丙烯酰胺凝胶中的ECM蛋白。 注意：为方便起见，使用预先染色的蛋白标记。 为了增加高分子量ECM蛋白的分辨率，延长凝胶运行时间，使得37 kDa的分子量标记运行接近凝胶和分子量标记物<37 kDa的底部已跑出凝胶。 用于ECM蛋白的蛋白质组分析，染色用蛋白质染色的凝胶和捕获图像。切感兴趣频带从凝胶中，用胰蛋白酶消化它们，并通过基质辅助激光解吸分析它们/电离（MALDI）-mass光谱<SUP> 13。 可替代地，用于对ECM提取物的更全面的分析，并分析整个样本，切片凝胶泳道段，消化它们与胰蛋白酶，以及执行液相色谱-质谱（LC-MS）14。 可替代地，对于免疫印迹15，在15 V转移从SDS-PAGE凝胶的蛋白质到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜至少1小时10分钟（半干法），以确保高分子量ECM蛋白的转移。可视转印到膜上用丽春红硫染色的总蛋白。 以下步骤4.11中，使用抗体来建立的存在和/或使个别ECM蛋白15的半定量分析。 该膜用2％在TBS-吐温20（封闭缓冲液）（重量/体积）奶粉在4℃下过夜阻塞。稀释至ECM蛋白的特异性抗体在封闭缓冲液中并在室温下与膜孵育1.5小时（抗体对fibronectin稀释1/600和抗体血小板-1稀释1/150; 补充表1）。 通过重新探测相同的印迹与抗体丰富细胞内蛋白质，如肌动蛋白或微管蛋白（抗肌动蛋白稀释1 / 10,000和抗微管蛋白稀释1/5000）测试的ECM隔离的质量。

Representative Results

中所描述的协议步骤1.1-1.5行为以去除细胞和离开细胞源ECM的后面。该协议是在COS-7细胞生长在玻璃盖玻片96小时进行，所述细胞源ECM通过荧光显微镜进行分析。的氢氧化铵处理除去该细胞有效，由细胞核和肌动蛋白细胞骨架的损失所确立，根据DAPI和鬼笔环肽染色，分别为（ 图1）。细胞用2M尿素提取不是氢氧化铵作为有效;治疗后，检测DAPI和鬼笔环肽染色的痕迹。 8M尿素不得不氢氧化铵类似的效果（ 图1）。接着，细胞来源的ECM被前后的氢氧化铵处理可视化（步骤2.1-2.11）。 COS-7细胞用单体红色荧光蛋白（MRFP）转染-tagged血小板反应蛋白1 C-末端三聚体，（mRFPovTSP1C）11，生长在35毫米的菜用网格玻璃基板。 两个小时后电镀，合适的方格包含表达mRFPovTSP1C多个健康细胞的共聚焦显微镜下观察。参考相位对比图像拍摄该区域的，然后荧光延时成像进行每隔1分钟2小时（ 图2A）。然后将细胞用氢氧化铵除去，并在盘的同一网格正方形混合物在相衬搬迁，然后通过荧光显微镜重新分析。将细胞不再存在于网格正方形，但mRFPovTSP1C保持在ECM内，通过荧光显微镜作为特征泪点（ 图2A）进行检测。沉积之前细胞去除对ECM任何mRFPovTSP1C鉴定通过比较荧光图案前和去除后的细胞。在两幅图像中确定的荧光泪点（Figu再如图2A所示，例如箭头）被推定为与ECM相关联。 然后与氢氧化铵处理被用于天然ECM从培养的贴壁细胞中分离。人真皮成纤维细胞（HDF）中生长在玻璃盖玻片96小时。细胞用氢氧化铵除去，则ECM被用抗胶原蛋白I抗体，其表现出的特性纤维状和小梁染色图案16（ 图2B）进行探测。纤连蛋白图案形成围绕固定的，非透化的大鼠软骨肉瘤细胞（RCS）和ECM内检测了除去RCS细胞（ 图2C）的后。 ECM的氢氧化铵隔离还无菌条件下进行，以便“测试”电池可以重新铺板于ECM的表型或功能性研究。例如，“测试”的COS-7细胞2小时镀上由RCS的细胞产生的无菌的ECM，和叔母鸡他们被固定，透，以及用于通过FITC标记的鬼笔环肽染色F-肌动蛋白组织分析，相比于COS-7细胞产生自己的ECM（步骤3.1-3.9）（ 图3）。 在更大的规模，使用该方法，以用于生化程序隔离的ECM。例如，RCS细胞生长于两个100 MM细胞培养皿为7天，并在步骤4.1-4.7所述的方法来进行。在细胞来源的ECM蛋白被刮他们进入热SDS-PAGE样品缓冲液收集并在还原条件下通过SDS-PAGE上分离7％聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶染色蛋白质，和四个主要条带分别分离并通过质谱法（ 图4A）进行分析。一些ECM蛋白，包括纤维连接蛋白，血小板反应蛋白1（TSP1），血小板反应蛋白5 /软骨寡聚基质蛋白（TSP5 / COMP），以及胞外基质蛋白1被鉴定（ 图4B）。另外，ECM的小规模的制剂可以通过免疫印迹进行评估。例如，从异位表达mRFPovTSP1C通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，并探查RFP与抗RFP抗体（ 图4C）COS-7细胞的细胞源ECM。这种技术是足够敏感以检测TSP1（mRFPovTSP1C）的天然三聚体和工程化的五聚体的TSP1 C-末端区域（MRFP-TSP-5-1C）17（ 图4C）之间在沉积的差异。调查HDF的内源ECM的，在细胞裂解物中或分离的细胞外基质的特定蛋白质的存在通过免疫印迹检查。在ECM中检测到的特征的ECM蛋白纤连蛋白和血小板反应蛋白1，而丰富的胞内蛋白质α微管蛋白和β肌动蛋白分别从分离ECM（ 图4D）不存在。 <p class="jove_content" fo:keEP-together.within页=“1”> 图1：细胞去除方法的比较。将COS-7细胞以高密度生长在盖玻片上96小时，固定在2％的PFA，而在0.5％的Triton X100透化，或作为细胞去除指示进行处理。盖玻片然后用FITC-鬼笔环肽染色来可视化F-肌动蛋白和DAPI形象化细胞核。比例尺= 25微米。这个数字是从日报的原始出版物细胞科学11修改。 请点击此处查看该图的放大版本。 图 2： 隔离ECM ECM蛋白的鉴定。 （A）的相衬和荧光图像COS-7细胞表达mRFPovTSP1C，生长在35毫米菜2小时玻璃底，网格基地。图像之前和氢氧化铵除去细胞之后被示出。网格信的边缘用虚线相位对比图像中指示。白色箭头指示在场前后细胞去除后，荧光泪点的例子。我在间接免疫荧光的HDF的ECM胶原的（B）的检测。 HDF中生长96小时，并用氢氧化铵除去，则ECM被染色的人类纤维状胶原一，ECM也被单独染色用FITC缀合的抗兔次级抗体。 （ 三 ）各地RCS细胞或分离的RCS ECM内的纤维连接蛋白的定位，用间接免疫荧光所检测。 RCS细胞生长48小时，固定在2％的PFA和染色纤连蛋白和用DAPI。在平行的菜肴，将细胞用20mM氢氧化铵除去和ECM被染色FIBRonectin和DAPI。细胞也沾上单独的FITC缀合的抗小鼠IgG抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。 图 3： 功能研究使用无菌ECM的。 RCS“矩阵生产者”细胞生长在玻璃盖玻片48小时，然后用20mM氢氧化铵在无菌条件下处理以除去细胞。铺板的COS-7“测试”细胞在盖玻片上具有或不具有隔离的RCS的ECM 2小时，固定在2％的PFA，透在0.5％的Triton X100和用FITC-鬼笔环肽染色来可视化F-肌动蛋白和DAPI来可视化的细胞核。 COS-7细胞接种在RCS ECM传播更加广泛，形成较大的微丝束（例如箭头）和边缘RUFFLES。 请点击此处查看该图的放大版本。 图4： 通过SDS-PAGE，质谱，或免疫印迹从隔离的ECM蛋白的鉴定。 （A）中的RCS细胞中生长7天，用20mM氢氧化铵除去将ECM被刮成含有100mM DTT的热SDS-PAGE样品缓冲液中。 ECM的制剂在还原条件下分离的SDS-PAGE上的7％聚丙烯酰胺凝胶。四显著带（箭头1-4）是由蛋白质染色鉴定。从RCS ECM频带1-4（B）的蛋白质通过MALDI质谱分析鉴定。 （C）的COS-7细胞表达任一mRFPovTSP1C（三聚体）或MRFP-TSP-5-1C（五聚体）中培养48小时，用20mM氢氧化铵除去，并且是ECM中分离成含有100mM DTT的热SDS-PAGE样品缓冲液中。 ECM的制剂还原条件下，转移至PVDF膜下分离通过SDS-PAGE上的7％聚丙烯酰胺凝胶，并用抗RFP抗体探测。该面板是从生物科学报告17的原始发布修改。 （D）的HDF中生长96小时，然后要么用在PBS中的2％脱氧胆酸（细胞裂解物）或用20mM氢氧化铵处理以除去细胞。将ECM被刮入热SDS-PAGE样品缓冲液中。两个级分通过SDS-PAGE在10％聚丙烯酰胺凝胶在还原条件，转移至PVDF膜下分离，并用抗体探测，所指示的。在每个面板的分子量标记的位置以kDa表示。 请点击此处查看该网络的放大版本古尔。

Discussion

该议定书中的关键步骤

该方法必须遵循以确保ECM的成功分离和分析一些关键的步骤。例如，氢氧化铵是用来除去细胞，并用于分析分离ECM。虽然氢氧化铵是在黑暗的水溶液稳定，可以在室温下保存，瓶必须严格重新密封在每次使用之间。因为气体可能从溶液中挥发，从而降低浓度，我们强烈建议在开始一个新的瓶每6-8周。此外，该工作液应新鲜作出每个实验。它同样重要的是将细胞完全在去离子水荧光棒洗涤除去。如果没有充分执行这些步骤，蜂窝材料可保留在盘中，污染下游分析。如果细胞已生长了10天或更长的时间，则可能需要额外的水洗涤。它是为n重要OTE所分离的ECM层通常相比于电池¹¹非常薄，所以在成像期间标识ECM时需要小心。为隔离的ECM成的SDS-PAGE样品缓冲液中有效提取，至关重要的是，在样品缓冲液中含有还原剂。对于最有效地除去ECM的，必须使用沸腾热样品缓冲液。对于实验，其中的ECM样本将通过SDS-PAGE电泳进行蛋白质染色或蛋白质组学解析，这是至关重要通过刮擦几个板价值的ECM的到样品缓冲液的相同等分部分以获得浓缩的样品。

修改和故障排除

ECM蛋白的生成和分泌能细胞类型之间显著变化，所以对于外基质分泌及沉积时间周期应当确定从头每种细胞类型。同样重要的是要知道，ECM组合物将在关系式T动态地改变培养¹⁸ O细胞密度和时间。这个因素应该设计实验时，应考虑到。显然，这种方法的细胞类型的选择是重要的，对于通过质谱法，这可能需要总的ECM蛋白的显着量的分析中提取ECM时尤为如此。

该技术的局限性

分泌ECM蛋白的水平非常低的细胞将是使用此方法使用更具挑战性。非贴壁细胞，三维细胞培养物，或细胞侵袭测定法是不适合在通过该方法本为ECM的隔离。该方法是最适合用于标准的“二维”的细胞培养物的使用。因为氢氧化铵萃取去除完全，ECM与细胞的上侧相关联，并且分泌的细胞，但非交联的，ECM蛋白也被去除，从下面和周围的基地上留下盘组装的ECM的薄层细胞^11,17的</SUP>。它是复杂的量化多少ECM由氢氧化铵萃取释放，因为所释放的材料还包括细胞外基质蛋白，要么之前分泌或从细胞表面摄取后是细胞内。

关于到现有/替代方法的技术意义

进行了广泛的孤立的ECM实验的能力是在细胞生物学和组织生理学的上下文中重要的是，它也具有用于组织再生和组织工程领域的影响。该方法比在纯化的胶原蛋白或其他纯ECM蛋白细胞组装复杂的ECM结构在家乡的大小，与本地交联机制，并与目前在适当起源细胞类型比单独的细胞外基质蛋白形成的凝胶的优势。例如，RCS ECM的蛋白质组研究表明丰富matrilins和COMP / TSP5，如预期一个软骨的ECM ^19,20（ 图4）。在一般情况下，细胞衍生ECM的分析是通过其性质阻碍作为广泛的多蛋白网络，其导致共价交联和许多ECM蛋白的不溶性，而且还由ECM的潜在污染与胞内蛋白提取物。旨在隔离从组织蛋白质组分析ECM的级分的多步骤过程中的总集合确定了²¹蛋白质的产生ECM蛋白的8％。然而，从ECM蛋白肽是确定的总肽的73％。这对于细胞源ECM的分离和分析的方法迅速且可靠地除去细胞物质，同时保持ECM蛋白。这种方法可用于各种细胞类型和下游应用的并且便于ECM生物学和细胞-ECM相互作用的在细胞培养物的分析。我们如何该方法可以在不同的尺度上使用的协议细节，以满足广泛的EXP关于ECM组织，动力学，或组合物erimental的问题，并以分离的ECM对细胞的作用效果。

掌握这一技术后，未来的应用方向或

展望未来，该方法可以适用于三维细胞培养使用;这将扩大其生理意义。脱细胞的天然组织有很大的潜力，作为丢失或受损组织的再生，作为替代移植，如心脏衰竭²²后的支架。它克服了供体的可用性和免疫排斥的问题的可能性。本报告中所描述的方法的未来的应用可以调查其与三维细胞培养物或组织脱细胞，这将进一步增加了该方法的范围使用。

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot