細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

過去数十年にわたり、細胞外マトリックス（ECM）は、複数の細胞の生理学的および病理学的プロセスに関与している、さまざまな動的な、複雑な環境として認識となっています。組織レベルでは、ECMは、細胞シグナル伝達、運動性、分化、血管新生、幹細胞生物学、腫瘍形成、線維症、 など ^1,2に影響^を与えます。 ECM組織とECM依存性プロセスの研究は、このように細胞生物学および組織生理学のための広い意味を持っています。 ECM組成物、組織、および機能的特性のメカニズムの理解に到達するために、ECMの正確な分離のための方法が必要とされます。組織³から分離依拠ECMタンパク質の初期の同定のに対し、培養細胞からのECMの製造は、今より普及しています。

細胞由来のECMの単離および分析は、2つの主な理由のために複雑です。まず、細胞の存在とIR豊富な細胞内タンパク質は、それが困難な個別の細胞外構造としてECMを分離することができます。実際、いくつかのECMタンパク質は、細胞内と同様にECM ⁴における役割を担っています。 ECM内のタンパク質の研究は細胞内の役割と混同しないようにしている場合、したがって、細胞由来のECMからの細胞内タンパク質の効率的な除去が不可欠です。第二に、細胞由来のECMは、多くの場合、共有架橋ECMアセンブリ上にあり、標準的な洗浄剤で、したがって不溶性であり、多くの大規模な、オリゴマータンパク質、から構成されています。これらの特性は、抽出およびECMのさらなる分析を複雑にすることができます。これらの問題に対処するために、この方法は、細胞成分からECMタンパク質の効率的な分離を可能にすることが要求されます。

いくつかの方法は、細胞培養または組織抽出物のいずれかからECMを分離するための文献に記載されています。これらの方法の多くは、豊富なECM PRの抽出を目的としていますotein、組織からコラーゲン、および中性塩^3、酸性条件^5,6、またはペプシン⁷の使用を含みます。組織抽出物からの総ECMの単離は、多くの場合、前のECMの単離組織の脱細胞化することを含みます。例えば、逐次抽出方法は、ヒトの心臓組織⁸からECMを分離することが記載されています。まず、緩く結合したECMタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の前に0.5 M NaClで抽出した細胞を除去するために使用しました。最後に、残りのECMタンパク質は、4Mグアニジン^8を用いて抽出しました。 ECMはまた、8 M尿素^9を使用して脱細胞化試料から可溶化することができます。他の技術は、遠心分離により、可溶性細胞溶解物から不溶性のECMタンパク質を分離する前に、細胞とECMの両方を抽出するために、例えば、デオキシコール酸¹⁰などの界面活性剤を使用します。

このレポートに記載された細胞由来のECMの単離および分析のための方法は、再現を提供しますインサイチュ免疫蛍光内により分析またはさらなる生化学的分析のために抽出することができる細胞由来のECMを残し、細胞物質を除去するためducible方法。この方法は、任意の接着細胞タイプに適合させることができる、そのような免疫ブロット法または質量分析などの下流の手順のために、または機能的研究において、単離されたECMの利用のためにスケールアップすることができます。この方法はまた、リアルタイムで目的のタグ化タンパク質のECMの沈着を追跡するために、生細胞の共焦点顕微鏡と組み合わせて使用​​することができます。これは、グリッド、ガラス底のディッシュを使用することによって達成されます。全体的に、アプローチは、細胞由来のECMの正確な分離と、個々のECMタンパク質の沈着とダイナミクスを認識し、モニターするためのスコープを提供します。

Protocol

水酸化アンモニウム溶液による細胞の1取り外し適切な密度でプレーティングすることによって接着細胞を準備します。 注：細胞は、分析のための十分なECMを生成する任意の接着細胞タイプにすることができます。ここでは、COS-7細胞、SV-40ウイルスDNA配列を含む、アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞様細胞株の使用を記載しています。 RCSラット軟骨肉腫細胞株。または正常ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、少年包皮から株。 HDFは、通路1から通路8のみに使用されています。 板生細胞とECMのイメージングのため、固定されたECMの蛍光顕微鏡研究のための、または小規模な機能アッセイのための細胞由来のECMの製造のためのカバースリップ上の細胞。 SDS-PAGE分析を、免疫ブロット、またはプロテオミクス研究のための細胞培養皿に細胞をプレート。 注：細胞培養条件（プレートに細胞および培地の数）は、細胞のタイプに依存します。プレートに細胞数のことを行う必要があります特定の細胞株または細胞株について経験的に確立されます。 典型的には> 16時間、細胞がECMを堆積するのに適した時間を許可します。注：時間は、細胞型に依存し、経験的に決定される必要があります。異所性発現を行った場合は、目的のトランスフェクトされたタンパク質の発現およびECMの沈着のための適切な時間を与えます。 換気扇では、脱イオンH 2 Oで原液1/14に希釈して適当な容器に20 mMの水酸化アンモニウムを準備インキュベーターから細胞を取り出して、そっと培地を除去します。静かに皿の壁に注入することによって2+ / MgのCa 2+をすることなく、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。二回皿をロックし、プラスチック製のトランスファーピペットで液体を除去します。二回以上繰り返します。 抽出フードでは、各皿を傾け、プラスチック製のトランスファーピペットでステップ1.2からPBSを削除します。 3を追加100-mmディッシュ当たり水酸化アンモニウムmLの、5分間室温でそれらをインキュベートします。 5分間のインキュベーション期間中、穏やかにすべての細胞の溶解を確実にするために皿毎分攪拌します。ステップ1.4~1.7はまた、抽出フード内で行われます。 注意：代替細胞除去剤は、10分間、細胞と共にインキュベートされる2 M又は8 M尿素を含みます。 ロッキングで、100ミリメートル皿当たり少なくとも20ミリリットル、各皿に脱イオンH 2 O大量のを追加します。水酸化アンモニウム可溶化材料-水酸化アンモニウム、溶解した細胞、および脱イオンH 2 O-による転送ピペットで吸引で構成されて廃棄してください。液体廃棄物用の容器の中に、この廃液を転送します。 すべての水酸化アンモニウム可溶化物質の完全な除去を確実にするために大量の脱イオンH 2 O 4回以上の不溶性ECM層を洗浄します。 免疫蛍光法によってECMの検査のために、2％を追加することにより、ECMを修正パラホルムアルデヒド（PFA; 100 mmディッシュ当たり3 mL）で10分間室温で。 注意：PFAは、皮膚や目に接触し、肺の損傷、窒息、意識不明、または死亡を生成することができます深刻な露出オーバーの場合は非常に危険です。それだけ抽出フード内で扱われるべきであり、個人用保護具を着用する必要があります。 ステップ1.2のように、PBSで2回各固定サンプルを洗浄し、適切な廃液容器にPFA液を処分。必要であれば、蛍光顕微鏡検査のためにそれらを準備する前に、4℃でPBSにおけるECMサンプルを格納します。 生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージングによって、ECMタンパク質の2トラッキング沈着血球計数器で細胞をカウントします。 COS-7細胞は、トランスフェクションのための60mmの細胞培養皿に250,000細胞をプレート。 注：生細胞イメージングのために、細胞は、対象のECMタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされる必要があり、遺伝的にコードされた蛍光を発するとインフレームで融合ntのタグ。これは、生細胞画像化の間に関心のECMタンパク質の同定を可能にすることです。 イメージング用の35 mmのグリッド化、ガラス底の皿にタンパク質発現（ 例えば、16時間）に適した時間の後、トリプシンEDTA溶液でディッシュから細胞を除去し、血球計数器でそれらをカウントし、プレート〜15万細胞。細胞のための2時間は、再接続すると（時間は細胞型に依存し、経験的に確立されなければならない）ECM沈着を開始することを許可します。 注：これは画質に影響を与える赤の色合いを与えることができるように、フェノールレッドを含まない細胞培地を使用してください。 上記の2時間の期間中、37℃のインキュベーター室およびCO 2供給と共焦点顕微鏡を設定します。チャンバー内の皿の温度が撮影前に37℃に安定化させます。これは、1時間ほどかかる場合があります。 30分間の蛍光細胞マーカーと35ミリメートルグリッド化皿に播種した細胞をインキュベートします。その後、細胞を洗浄二回、フェノールレッドを含まない培地での撮像前に。 注：細胞質の蛍光マーカーは、細胞容積を視覚化するために使用することができ、または膜組み込みマーカーは、セルの端を視覚化するために使用することができます。 共焦点顕微鏡で20X対物レンズと位相コントラストを使用して、接着性、健康な細胞の数（> 3）を含む適切なグリッドの正方形を識別します。 63Xまたは100X目的や蛍光顕微鏡下での適切な波長を使用して、選択したグリッド正方形内の細胞中の選択肢の標的タンパク質の発現を確認してください。 zスタックソフトウェアを使用して、蛍光および位相差タイムラプスイメージングを設定します。ちょうど細胞体以上であるためにちょうどECM層と「終了」スタックの下にあることを「開始」スタックを設定します。細胞の種類に応じて、合計で0.3ミクロンまでのzステップサイズと5〜10μmの深さの間にz軸音量を設定します。これは、時点ごとの15-30のzセクションの間に得られます。 CAPTUR（赤色蛍光タンパク質（RFP）のために、励起= 555 nmおよび発光= 584 nm）を位相コントラスト画像定期的に設定された時間期間にわたってE蛍光。例えば、2分の時間間隔、2時間の時間を設定するタイムラプスソフトウェアを使用しています。定義された期間にわたってのz断面画像のキャプチャを開始し、「開始」ボタンを選択します。 ECMへの関心の蛍光標識タンパク質の局在を確認するために、ステップ1.1から1.5に記載されているように、時間期間の終了時に、皿から細胞を除去します。 関連するグリッドの正方形を再配置する位相コントラストイメージングおよび20X対物レンズを使用してください。 63X対物レンズに切り替えて、蛍光顕微鏡下でECM層を識別します。抽出前の画像にこの画像を比較細胞機能アッセイのための細胞由来のECMの3無菌調製カバースリップし、別のPOPUの細胞（「マトリックスプロデューサー」細胞）の1の人口を育てます少なくとも24時間100ミリメートル細胞培養皿で標準的な培養中レーション（ "テスト"細胞）。 注：これらは、任意の二つの異なる接着性細胞型であることができ、実験設計は、蛍光タグECMタンパク質を発現するために、1つまたは両方の細胞集団のトランスフェクションを含むことができます。 滅菌0.2介しを通過させることによって、細胞培養のために使用されるように、層流フード内で、カルシウムを含まないPBSの無菌溶液を調製2+ / Mgの2+、20 mMの水酸化アンモニウム（ステップ1.3参照）、および脱イオンH 2 O適切な無菌の容器にミクロンフィルター。 滅菌技術を維持し、穏やかに無菌PBS（ステップ1.2参照）でカバーガラス上で3回「マトリックスプロデューサー」細胞を洗浄します。 滅菌ピペットを用いて吸引によってPBSを削除し、適切な廃液容器に入れて処分します。 20 mMの無菌水酸化アンモニウム（3mLの/ 100ミリメートル皿）を追加した間隔で揺り動かしながら5分間、それらをインキュベートします。 大量の追加滅菌脱イオンH 2 Oの「マトリックスプロデューサー」ディッシュ、100ミリメートル皿当たり少なくとも20ミリリットル、ロッキングであり、適切な廃棄容器に細胞溶解物を離れて注ぐします。 水酸化アンモニウム可溶化物質の完全な除去を確実にするための手順を繰り返し3.5 4回。 注：カバーガラス上で「マトリックスプロデューサー」細胞によって堆積ECMは、その後、目的の任意の試験細胞との機能的アッセイのための滅菌ECMを提供します。 試験細胞がディッシュから剥離されるまで、100ミリメートルディッシュ（ハンクス平衡塩溶液中のVトリプシン/ワット0.05％と0.02％のw / vのEDTA）当たりトリプシンEDTA溶液1.5mLを持つ細胞ストック皿からテスト細胞をインキュベート。 、細胞培地を追加し、5分間400×gで試験細胞を遠心分離し、上澄み液を除去します。 新鮮な、滅菌培地中の試験細胞を再懸濁し、血球計でそれらを数えます。 coversli上の滅菌は、単離されたECM上にこれらの試験適切な数の細胞をプレートpsの。 2-3時間、又は実験的設計のために必要な時間のための適切な細胞培地で培養して。 、アクチン細胞骨格の組織を調べ、2％PFAで試験細胞を固定し、フルオレセインイソチオシアネートとそれらを染色（FITC）-phalloidin（励起= 490 nmおよび発光= 525 nm）の「F-アクチンと4で可視化するために、6〜 -diamidino -2-フェニルインドール（DAPI;励起= 358 nmおよび発光= 461 nm）を核11を可視化します。 注：自分のECM上に播種し、試験細胞と異種細胞由来のECM上に播種し、試験細胞における形態とアクチンの組織を比較してください。 SDS-PAGE、イムノブロット分析、またはプロテオミクスのためのECMの4.絶縁分泌およびECMの沈着を可能にするために、細胞の種類に応じて、24〜96時間、100ミリメートル細胞培養皿（プロテオミクスのために5〜10の皿やイムノブロッティングのために1-2皿）の利息の接着細胞を成長させます。 DESCRなどの細胞を削除しますステップ1.1から1.5にibed。 皿の底に残留H 2 Oを排出する角度で各プレートを傾け、そしてプレートが完全に乾燥するまで慎重P200のピペットで、残りのH 2 Oを除去します。 並行して、熱SDS-PAGEサンプルバッファーをヒートブロックを用いて、2分間95℃で100mMのジチオスレイトール（DTT）を含有し、その後プレートに加えます。 100ミリメートルプレートあたりのサンプルバッファー200μLのは、イムノブロットによって検査されるサンプルに適しています。 質量分析によってECMを分析するために、それを95℃に再加熱し、（下記のステップ4.5および4.6に記載の）皿からSDS-PAGE試料緩衝液を収集し、そしてにわたって同じ一定分量を使用して、より濃縮されたサンプルを得ます2-3追加のプレート。 徹底的に皿のすべての領域が掻き取られていることを確認して、皿からECMをこすり取る際には、セルスクレーパーを使用してください。 セルスクレーパーで、皿の片側にサンプルを収集し、200でそれを削除しますチューブにμLピペットチップ。 ECM材料の損失を最小限にするためにチューブに細胞スクレーパー先端から残留SDS-PAGE試料緩衝液抽出物を移します。濃縮されたサンプルについて、95℃に同じSDS-PAGEサンプル緩衝液のアリコートを再加熱し、2-3追加の板を渡ってそれを再使用します。 7％または4ないし7％勾配ポリアクリルアミドゲルのいずれかを使用して、SDS-PAGE 12によってECMタンパク質を解決します。 注：これは、前染色タンパク質マーカーを使用すると便利です。 高分子量のECMタンパク質の分解能を高めるために、37kDaの分子量マーカーが近いゲルおよび分子量マーカー<37kDaのの下に実行されたゲルをオフに実行しているようなゲル走行時間を延長します。 ECMタンパク質のプロテオーム解析のため、タンパク質染色でゲルを染色し、画像をキャプチャします。ゲルから目的のバンドを切り取り、トリプシンを用いてこれらを消化し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI） – 質量分析によってそれらを分析<SUP> 13。 また、ECM抽出物のより包括的な分析のためと、全体のサンプルを分析セクションにゲルのレーンをスライスし、トリプシンでそれらを消化し、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）14を実行します。 あるいは、15をイムノブロッティングのために、高分子量のECMタンパク質の移動を確保するために、少なくとも1時間10分（半乾式法）、15 Vでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にSDS-PAGEゲルからのタンパク質を転送します。ポンソーS染色で膜に転写し、全タンパク質を可視化します。 次のステップ4.11、プレゼンスを確立および/または個々のECMタンパク質15の半定量的分析を行うために抗体を使用します。 一晩4℃で2％のTBS-Tween 20を（ブロッキング緩衝液）中で（w / v）のミルクで膜をブロックします。ブロッキング緩衝液中でのECMタンパク質に特異的な抗体を希釈し、室温で1.5時間、膜をインキュベート（FIBする抗体ronectinは、トロンボスポンジン1 1/150希釈に1/600と抗体を希釈しました。 補足表1）。 このようなアクチンやチューブリン（抗アクチンは、1 / 10,000に希釈し、抗チューブリンは、1/5000に希釈）など豊富な細胞内タンパク質に対する抗体を用いて同じブロットを再プローブすることによってECM分離の品質をテストします。

Representative Results

プロトコルは、細胞を除去し、細胞由来のECMを残すために段階的に1.1から1.5の行為を説明しました。プロトコルは、ガラスカバースリップ上で96時間成長させたCOS-7細胞上で実施し、細胞由来のECMは、蛍光顕微鏡によって分析しました。 DAPIおよびファロイジン染色、それぞれ（ 図1）によれば、細胞核とアクチン細胞骨格の喪失によって確立されたとして水酸化アンモニウム治療は、効果的に細胞を除去しました。 2 M尿素を用いた細胞の抽出は、水酸化アンモニウムのように有効ではなかったです。 DAPIおよびファロイジン染色の痕跡は、治療後に検出されました。 8 M尿素を水酸化アンモニウムと同様の効果（ 図1）を有していました。次に、細胞由来のECMは、水酸化アンモニウム処理前および後の可視化した（2.1から2.11ステップ）。 COS-7細胞は、単量体赤色蛍光タンパク質（MRFP）、トロンボスポンジン-1 C末端三量体-タグ、（mRFPovTSP1C 1）でトランスフェクトしました。1とグリッドガラスベースで35mm皿上で増殖させました。 mRFPovTSP1Cを発現している複数の健康な細胞を含んでいた二時間後メッキ、適切なグリッドの正方形を、共焦点顕微鏡下で可視化しました。基準位相コントラスト画像は、この領域を撮影した後、蛍光タイムラプスイメージングは、2時間（ 図2A）ごとに1分間行いました。次いで、細胞を、水酸化アンモニウムを用いて除去し、皿に同じグリッド正方形は、位相差の下に再配置した後、蛍光顕微鏡によって再分析しました。細胞は、もはやグリッド正方形の中に存在していなかったが、mRFPovTSP1C特性涙点（ 図2A）のような蛍光顕微鏡によって検出され、ECM内に留まりました。細胞除去の前ECMに堆積任意mRFPovTSP1Cは、蛍光パターンの前、細胞の後の除去を比較することによって同定しました。両方の画像で識別された蛍光涙点（Figu図2（a）再、例では、矢印で示す）ECMと関連していることが推測されます。 水酸化アンモニウム処理を培養し、接着細胞からの天然のECMを分離するために使用されました。ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）を、96時間、ガラス製カバースリップ上で増殖させました。細胞は、水酸化アンモニウムを用いて除去し、ECMを特徴線維と網状染色パターン16（ 図2B）を証明し、抗コラーゲンI抗体でプローブしました。フィブロネクチンパターニングはRCS細胞（ 図2C）を除去した後の周りに固定され、非透過性ラット軟骨肉腫細胞（RCS）およびECM内を調べました。 「試験」細胞は、表現型または機能的研究のためにECMに再プレートすることができるように、ECMの水酸化アンモニウムの分離はまた、無菌条件下で行いました。例えば、「テスト」COS-7細胞を滅菌RCS細胞によって産生されるECM、およびtに2時間平板培養しました編彼らは自身のECMを生成するCOS-7細胞（3.1から3.9ステップ）（ 図3）と比較して、固定し、透過処理、およびFITCファロイジン染色によってF-アクチン組織を分析しました。 大規模では、この方法は、生化学的な手順については、ECMを分離するために使用しました。例えば、RCS細胞を、7日のための2つの100 mmの細胞培養皿上で増殖させ、およびステップ4.1から4.7の手順に従いました。細胞由来のECM中のタンパク質は、ホットSDS-PAGEサンプルバッファーにそれらを掻き取って回収し、還元条件下で7％ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEにより分離しました。ゲルをタンパク質について染色し、4の主要なバンドをそれぞれ単離し、質量分析（ 図4A）で分析しました。 5 /軟骨オリゴマー基質タンパク質（TSP5 / COMP）、および母系-1トロンボスポンジン、フィブロネクチンを含むECMタンパク質、数、1（TSP1）のトロンボスポンジンは、（ 図4B）を同定しました。代替的に、ECMの小規模調製物は、免疫ブロットによって評価することができます。例えば、異所mRFPovTSP1Cを発現するCOS-7細胞からの細胞由来のECMは、PVDF膜に転写し、SDS-PAGEで分離し、抗RFP抗体（ 図4C）とRFPをプローブ。この技術は、TSP1（mRFPovTSP1C）のネイティブトリマーおよびTSP1 C末端領域（MRFP-TSP-5-1C）17（ 図4C）のペンタマーエンジニア間の堆積の違いを検出するのに十分な感度です。 HDFの内因性のECMを調べるために、細胞溶解物または単離されたECM内の特定のタンパク質の存在は、免疫ブロット法によって調べました。豊富な細胞内タンパク質αチューブリンとβアクチンは、単離されたECM（ 図4D）から存在しなかったのに対し、特徴的なECMタンパク質フィブロネクチンとトロンボスポンジン1は、ECMで検出されました。 <p class="jove_content" fo:keEP-together.withinページ= "1"> 図1：細胞除去の方法の比較。 COS-7細胞を、カバーガラス上で96時間高密度に増殖させ、2％PFAで固定し、0.5％トリトンX100で透過処理、または細胞を除去するために示されているように処理したました。カバースリップは、次いで、核を可視化するために、F-アクチンとDAPIを可視化するために、FITC-ファロイジンで染色しました。 =25μmのスケールバー。この図は、Cellの科学11の雑誌の元の出版物から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2： 単離されたECMにおけるECMタンパク質の同定。 （A）の位相差および蛍光画像をmRFPovTSP1Cを発現し、2時間、ガラス底、グリッドベース35 mmディッシュ上で増殖させたCOS-7細胞。画像は、水酸化アンモニウムによる細胞の除去の前後に示されています。グリッド文字のエッジが点線で位相コントラスト画像に示されています。白矢印は、細胞除去の前と後に存在した蛍光涙点の例を示しています。 （B）、間接免疫蛍光法によってHDF ECMにおけるコラーゲンの検出I。 HDFは、96時間増殖させ、水酸化アンモニウムを用いて除去し、ECMは、ECMはまた、単独で、FITC結合抗ウサギ二次抗体で染色したヒト線維状コラーゲンIについて染色しました。間接免疫蛍光によって検出されるように（C）RCS細胞の周りまたは単離されたRCS ECM内のフィブロネクチンの局在、。 RCS細胞を2％PFAで固定し、48時間、増殖させ、そしてフィブロネクチンおよびDAPIで染色しました。並列皿に、細胞を、20 mMの水酸化アンモニウムを用いて除去し、ECMをFIBRについて染色しました。onectinおよびDAPIで。細胞はまた、単独で、FITC結合抗マウスIgG抗体で染色しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3： 機能研究のための無菌ECMの使用。 RCS「マトリックスプロデューサー」細胞をカバーガラス上で48時間増殖させ、次いで細胞を除去するために無菌条件下で20 mMの水酸化アンモニウムで処理しました。 COS-7 "テスト"細胞を0.5％トリトンX100で透過処理し、2％PFAで固定し、または2時間、単離されたRCS ECMなしでカバースリップ上に播種し、核を可視化するためのF-アクチンとDAPIを可視化するために、FITCファロイジンで染色しました。 RCS ECM上に播種したCOS-7細胞は、より広範囲に広がり、大規模なマイクロフィラメントの束（例は矢印で示す）とエッジのラフを形成しましたレ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4：SDS-PAGE、 質量分析、または免疫ブロット法により単離し、ECMからのタンパク質の同定。 （A）RCS細胞を7日間増殖させ、20mMの水酸化アンモニウムを用いて除去しました。 ECMは、100mMのDTTを含有するホットSDS-PAGEサンプル緩衝液中に掻き上げました。 ECM調製物は、還元条件下で7％ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEにより分離しました。四つの重要なバンド（矢印1-4）タンパク質染色によって同定しました。 RCSのECMバンド1-4の（B）タンパク質を、MALDI質量分析法により同定しました。 mRFPovTSP1C（トリマー）またはMRFP-TSP-5-1C（五量体）のいずれかを発現する（C）COS-7細胞を、48培養しましたHおよび20 mMの水酸化アンモニウムを用いて除去し、ECMを、100mM DTTを含有するホットSDS-PAGEサンプル緩衝液中に単離しました。 ECM調製物は、還元条件下で7％ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に移し、そして抗RFP抗体でプローブしました。このパネルは、バイオサイエンスレポート17内の元の出版物から変更されています。 （D）HDFは、96時間増殖させ、次いで細胞を除去するためにPBS中の2％デオキシコール酸（細胞溶解物）または20 mMの水酸化アンモニウムのいずれかで処理しました。 ECMは、ホットSDS-PAGEサンプル緩衝液中に掻き取りました。 2つの画分を、還元条件下で10％ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に転写し、示されるように、抗体でプローブしました。各パネルでは、分子量マーカーの位置は、キロダルトンで示されています。 このFiのの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。グレ。

Discussion

プロトコル内の重要なステップ

この方法は、ECMの成功の分離と分析を確実にするために従わなければならないいくつかの重要なステップがあります。例えば、水酸化アンモニウム、細胞を除去し、分析のためにECMを単離するために使用されます。水酸化アンモニウムは、暗所で、水溶液中で安定であり、室温で保存することができるが、ボトルをしっかりと各使用の間に、再密封されなければなりません。ガスは、このように濃度を低減、溶液から蒸発する可能性があるため、私たちは強く、すべての6-8週間新鮮なボトルを開始するお勧めします。また、作業溶液は、各実験のために新鮮になされるべきです。細胞が完全に脱イオン水に大量の洗浄液で除去することも不可欠です。これらのステップは適切に行われない場合、細胞物質は、皿上に残り、下流分析を汚染する可能性があります。細胞は10日間以上増殖させた場合には、付加的な水洗浄を必要とすることができます。これは、nに重要です撮像中にECMを特定する際には注意が必要とされるように、孤立したECM層は、通常、セル¹¹に比較して非常に薄いOTE。 SDS-PAGEサンプル緩衝液中に単離されたECMの効果的な抽出のために、サンプルバッファは、還元剤を含有することが必須です。 ECMの最も効果的に除去するために、沸騰ホットサンプルバッファを使用する必要があります。 ECMサンプルがタンパク質染色またはプロテオミクスのためにSDS-PAGE電気泳動によって分離された実験のためには、サンプル・バッファの同じアリコートにECMのいくつかのプレートを、価値をこすることにより、濃縮試料を得るために重要です。

修正およびトラブルシューティング

ECMタンパク質の産生および分泌は、細胞型の間で有意に変化し得るので、ECMの分泌および堆積のための期間は、各細胞型のためのデノボ決定されるべきです。 ECM組成物は関係トンで動的に変化することを知っておくことも重要です文化¹⁸中のO細胞密度と時間。実験を設計する場合、この要因を考慮に入れるべきです。明らかに、この方法のための細胞型の選択は、総ECMタンパク質のかなりの量を必要とすることが質量分析による分析のためにECMを抽出する場合に特に重要です。

テクニックの制限事項

ECMタンパク質の非常に低レベルを分泌する細胞は、この方法で使用するためのより困難であろう。非接着細胞を、三次元細胞培養物、または細胞浸潤アッセイは、この方法によるECMの単離のために現時点では不適当です。方法は、標準的な「2次元」とは、細胞培養での使用のために最も適しています。水酸化アンモニウム抽出完全細胞を除去するため、ECMは、細胞の上部側面に関連し、分泌するが、非架橋、ECMタンパク質はまた、皿に塩基下及び周りから組み立てられたECMの薄層を残して、除去されますセル^11,17の</SUP>。放出材料は前の分泌または細胞表面からの吸収後のいずれかで、細胞内であるECMタンパク質を含むので、水酸化アンモニウム抽出により放出されるどのくらいのECM定量化するために複雑です。

既存の/代替方法に関して技術の意義

単離されたECMを用いた実験の広い範囲を実施する能力は、細胞生物学および組織生理学の文脈において重要であり、それはまた、組織再生および組織工学の分野に影響を有します。この方法は、細胞が天然の架橋メカニズムと、原点の細胞型に適切な比率で存在する個々のECMタンパク質と、それらの天然のサイズで複雑なECM構造体を組み立てることで精製されたコラーゲンまたは他の精製されたECMタンパク質から形成されたゲル上の利点を有します。以下のために予想されるように、例えば、RCS ECMのプロテオミクス研究では、豊富なmatrilinsとCOMP / TSP5を実証しました軟骨ECM ^19,20（ 図4）。一般的に、細胞由来のECMの分析は、共有架橋および多くのECMタンパク質の不溶性になる大規模な、多タンパク質ネットワークのような、また、細胞内タンパク質とのECM抽出物の潜在的な汚染によって、その性質によって妨げられています。プロテオーム解析のための組織からECM画分を単離するために設計された多段階の手順は^、21を同定^したタンパク質の全体集合にECMタンパク質の8％を得ました。しかし、ECMタンパク質からのペプチドが同定された総ペプチドの73％でした。細胞由来のECMの単離および分析のためのこの方法は、迅速かつ確実にECMタンパク質を保持しながら、細胞物質を除去します。この方法は、細胞型および下流用途の範囲に使用され、細胞培養におけるECMの生物学及び細胞-ECM相互作用の分析を容易にすることができます。この方法は、EXPの広い範囲に対処するために、異なるスケールで適用することができる方法を我々のプロトコルの詳細ECM組織、ダイナミクス、または組成物、および細胞上の孤立したECMの機能的効果に関してerimental質問。

このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方

将来的に見ると、この方法は、三次元細胞培養物での使用に適合させることができます。これは、その生理的関連性を拡大します。脱細胞ネイティブ組織が紛失または損傷した組織の再生のための、そのような心不全²²後などの移植の代替として、足場として大きな可能性を秘めています。これは、ドナーの利用可能性および免疫拒絶の問題を克服する可能性を有します。このレポートに記載された方法の将来のアプリケーションは、さらに、このアプローチの範囲を増加させる3次元細胞培養物または組織の脱細胞化とその使用を調査することができます。

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot