Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten hat sich die extrazelluläre Matrix (ECM) als eine vielfältige, dynamische und komplexe Umgebung geworden erkannt, die in mehreren Zell-physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. Auf der Ebene der Gewebe beeinflusst die ECM – Zell – Signal, Motilität, Differenzierung, Angiogenese, Stammzellbiologie, Tumorentstehung, Fibrose, usw. ^1,2. Die Studie von ECM-Organisation und ECM-abhängige Prozesse hat somit weitreichende Auswirkungen für die Zellbiologie und Gewebephysiologie. Um ein mechanistisches Verständnis von ECM-Zusammensetzung, Organisation und funktionelle Eigenschaften, Methoden für die präzise Trennung von ECM erreichen sind erforderlich. Während die früheste Erkennung von ECM – Proteine verlassen nach der Isolierung aus Geweben ³ hat sich die Herstellung von ECM aus kultivierten Zellen nun häufiger geworden.

Die Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM ist kompliziert aus zwei Hauptgründen. Erstens, die Anwesenheit von Zellen, und dieir reichlich intrazellulärer Proteine ​​kann es schwierig machen, die ECM als diskrete extrazelluläre Struktur zu isolieren. Tatsächlich haben einige ECM Proteine Rollen innerhalb der Zelle als auch in der ECM ^4; Daher ist die effiziente Entfernung von intrazellulären Proteinen aus Zellen stamm ECM ist entscheidend, wenn die Untersuchung von Proteinen innerhalb der ECM nicht mit ihren Rollen in der Zelle zu verwechseln ist. Zweitens Zellen stamm ECM wird von vielen großen, oligomere Proteinen, die oft kovalent vernetzt bei ECM Montage und sind daher unlöslich in Vollwaschmitteln. Diese Eigenschaften können Extraktions- und die weitere Analyse der ECM komplizieren. Um diese Probleme anzugehen, ist ein Verfahren erforderlich, die eine effiziente Trennung von ECM-Proteinen aus Zellkomponenten ermöglicht.

Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für die Isolierung von ECM entweder aus Zellkultur oder Gewebeextrakten beschrieben. Viele dieser Methoden sind bei der Extraktion des reichlich vorhandenen ECM pr gerichtetotein, Kollagen, aus Geweben und umfassen die Verwendung von Neutralsalzen ^3, sauren Bedingungen ^5,6 oder Pepsin ^7. Isolierung von Gesamt-ECM aus Gewebeextrakten beinhaltet oft Dezellularisierung des Gewebes vor der Isolierung des ECM. Zum Beispiel wurde ein sequentielles Extraktionsverfahren beschrieben , das ⁸ ECM aus menschlichem Herzgewebe isoliert. Zunächst wurden lose gebundene ECM-Proteine ​​extrahiert, mit 0,5 M NaCl vor der Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen. Schließlich wurden die verbleibenden ECM – Proteine unter Verwendung von 4 M Guanidin – ⁸ extrahiert. ECM kann auch von dezellularisierter Proben unter Verwendung von 8 M Harnstoff ⁹ gelöst werden. Andere Techniken verwenden Detergentien wie Desoxycholsäure ^10, beide Zellen und ECM zu extrahieren , bevor unlösliches ECM Proteine aus der löslichen Zelllysat durch Zentrifugation abtrennt.

Das Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM in diesem Bericht beschrieben wird, liefert eine Reproproduzierbar Verfahren zur Entfernung von Zellmaterial, so dass Zellen abgeleiteten ECM , die durch für weitere biochemische Analyse in situ Immunfluoreszenz oder extrahiert analysiert werden. Dieses Verfahren kann für jede adhärenten Zelltyp angepasst werden und kann für nachgeschaltete Verfahren skaliert werden, wie beispielsweise Immunoblotting oder Massenspektrometrie, oder für die Verwendung des isolierten ECM in funktionellen Studien. Das Verfahren kann auch in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie lebender Zellen verwendet werden ECM Ablagerung eines getaggten Proteins von Interesse in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird durch die Verwendung einer gerasterten, Glasbodenschale erzielt. Insgesamt bietet der Ansatz eine genaue Isolierung von Zellen abgeleiteten ECM und auch den Umfang zu identifizieren und die Abscheidung und die Dynamik der einzelnen ECM-Proteine ​​überwachen.

Protocol

1. Entfernung von Zellen mit Ammoniumhydroxidlösung Bereiten Sie adhärenter Zellen durch an der geeigneten Dichte Überzug. HINWEIS: Die Zellen können beliebige adhärenten Zelltyp sein, der für die Analyse ausreichend ECM erzeugt. Hier beschreiben wir die Verwendung von COS-7-Zellen, eine afrikanische grüne Affen-Nieren-Fibroblasten-ähnliche Zelllinie, die SV-40-Virus-DNA-Sequenzen enthält; RCS, eine Ratte Chondrosarkom Zelllinie; oder normalen humanen dermalen Fibroblasten (HDF) Stämmen aus juvenile Vorhaut. HDF sind aus dem Kanal 1 bis Kanal 8 nur dann verwendet. Platte, die Zellen auf Deckgläser für die Abbildung von lebenden Zellen und ECM, für die Fluoreszenzmikroskopie Studien von festen ECM, oder zur Herstellung von Zellen abgeleiteten ECM für kleine funktionelle Assays. Platte der Zellen auf Zellkulturschalen für die SDS-PAGE-Analyse, Immunoblot oder Proteomik-Studien. HINWEIS: Die Zellkulturbedingungen (Anzahl der Zellen und Kulturmedium zu plattieren) hängt vom Zelltyp. Die Zellzahl auf Platte müssenempirisch für die jeweilige Zelllinie oder Zellstamm aufgebaut werden. Lassen Sie eine geeignete Zeit für die Zellen ECM zu deponieren, in der Regel> 16 h. HINWEIS: Die Zeitdauer vom Zelltyp abhängen und müssen empirisch ermittelt werden. Wenn ektopische Expression leitenden, entsprechenden Zeit für die Expression des transfizierten Proteins von Interesse und zur Abscheidung von ECM. In einer Dunstabzugshaube, werden 20 mM Ammoniumhydroxid in einem geeigneten Gefäß durch die Stammlösung Verwässerungs 1/14 mit entsalztem H 2 O. Entfernen der Zellen aus dem Inkubator und schonend Kulturmedium zu entfernen. Fügen Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ / Mg 2+ , indem sie gegen die Wände der Schale sanft gießen. Rock the Gericht zweimal, und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Kunststoff Transferpipette. Wiederholen Sie zweimal. In einer Dunstabzugshaube, jedes Gericht kippen und die PBS aus Schritt 1.2 mit einem Kunststoff Transferpipette entfernen. In 3ml Ammoniumhydroxid pro 100-mm-Schale und inkubieren sie für 5 min bei Raumtemperatur. Während der 5-min Inkubationszeit leicht bewegen das Gericht alle min die Lyse aller Zellen zu gewährleisten. 1,4-1,7 Schritte auch in der Dunstabzugshaube durchgeführt werden. HINWEIS: Alternative Zellentfernungsreagenzien umfassen 2 M oder 8 M Harnstoff, der mit den Zellen für 10 min inkubiert werden. In reichlich entionisiertem H 2 O in jede Schale, mindestens 20 ml pro 100 – mm – Schale, mit Schaukeln. Entsorgen des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Material , das aus Ammoniumhydroxid zusammengesetzt ist, lysierten Zellen und deionisiertem H 2 O-durch Aspiration mit einer Transferpipette. Übertragen Sie diese Abfalllösung in einen Behälter für flüssige Abfälle. Waschen des unlöslichen ECM Schicht in reichlicher deionisiertem H 2 O viermal die vollständige Entfernung aller Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. Zur Untersuchung des ECM durch Immunofluoreszenz, fixieren Sie die ECM durch Zugabe von 2%Paraformaldehyd (PFA; 3 ml pro 100 mm Schale) bei Raumtemperatur für 10 min. Achtung: PFA ist sehr gefährlich im Falle von Haut- oder Augenkontakt und schweren Überbelichtung kann Lungenschäden, Würgen, Bewusstlosigkeit oder zum Tod führen produzieren. Es sollte nur in einer Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung gehandhabt werden sollte getragen werden. Waschen Sie jeden festen Probe zweimal mit PBS, wie in Schritt 1.2, und entsorgen Sie die PFA-Lösung in einen geeigneten Abfallbehälter. Falls notwendig, speichert das ECM Proben in PBS bei 4 ° C, bevor sie für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. 2. Tracking-Abscheidung eines ECM-Protein durch konfokale Mikroskopie Imaging lebender Zellen Zählen Sie die Zellen unter einem Hämozytometer. Für COS-7-Zellen, 250.000 Zellen auf einer 60 mm Zellkulturschale zur Transfektion plattieren. HINWEIS: Für die Live-Cell-Imaging, müssen die Zellen mit einem Vektor transfiziert werden codiert, das ECM-Protein von Interesse, fusioniert im Rahmen mit einem genetisch kodierten fluoreszierennt-Tag. Dies ist die Identifizierung des ECM-Protein von Interesse während der Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen. Nach einer geeigneten Zeit für die Proteinexpression (zB 16 h) , um die Zellen von der Schale mit Trypsin-EDTA – Lösung zu entfernen, so dass sie in einem Hämocytometer zählen, und Platte ~ 150.000 Zellen auf eine 35-mm – Gitter, Glasbodenschale für die Bildgebung. Allow 2 h für die Zellen wieder zu befestigen und ECM deposition (die Zeitdauer hängt von dem Zelltyp und muß empirisch ermittelt werden) zu beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Zellmedium, das nicht Phenolrot enthält, da dies eine rote Färbung geben können, die Bildqualität auswirkt. Während der obigen Zeitraum von 2 h, stellen ein konfokales Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator Kammer und einer CO 2 -Angebot auf. Dass die Temperatur in der Kammer und in der Schale auf 37 ° C vor der Bildgebung zu stabilisieren; dies kann bis zu 1 Stunde dauern. Inkubieren Sie die auf die Schale mit einem fluoreszierenden Zellmarker für 30 min gridded 35 mm plattierten Zellen. Dann waschen Sie die Zellenzweimal in Phenolrot-freiem Kulturmedium vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Eine cytoplasmatische können fluoreszierende Marker verwendet werden, um Zellvolumen sichtbar zu machen, oder ein membran Einbeziehung Marker verwendet werden können Zellränder sichtbar zu machen. Mit dem 20x-Objektiv und Phasenkontrast auf einem konfokalen Mikroskop, identifizieren ein geeignetes Planquadrat, das eine Anzahl (> 3) von adhärenten enthält, gesunde Zellen. Bestätigen Sie die Expression des Zielproteins der Wahl in den Zellen innerhalb des ausgewählten Planquadrat die 63X oder 100X Ziele und die entsprechenden Wellenlängen unter Fluoreszenzmikroskopie. Richten Sie Fluoreszenz und Phasenkontrast-Zeitraffer-Bildgebung einen z-Stack-Software. Stellen Sie die "Start" Stack zu sein knapp unterhalb der ECM-Schicht und dem "Ende" Stack knapp über dem Zellkörper zu sein. Stellen Sie die z-Schrittweite auf 0,3 um und die z-Volumen zwischen 5 und 10 & mgr; m Tiefe in insgesamt, je nach Zelltyp. Dies gibt zwischen 15-30 z Schnitte pro Zeitpunkt. Capture-Fluoreszenz (für rot fluoreszierendes Protein (RFP), Anregung = 555 nm und Emission = 584 nm) und Phasenkontrast-Bilder in regelmäßigen Abständen über einen festgelegten Zeitraum. Verwenden Sie zum Beispiel die Zeitraffer-Software das Zeitintervall, in 2 Minuten und die Dauer bis 2 h einzustellen. Wählen Sie die Schaltfläche "Start" Erfassung von z-Schnittbilder über den definierten Zeitraum zu beginnen. Am Ende des Zeitraums, entfernen Sie die Zellen, die aus Schale, wie 1,1-1,5 in den Schritten, die Lokalisierung des fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse in der ECM zu bestätigen. Verwenden der Phasenkontrast-Bildgebung und die 20x-Objektiv das entsprechende Planquadrat zu verlagern. Wechseln Sie in das 63X Ziel und zu identifizieren, die ECM-Schicht unter Fluoreszenzmikroskopie. Vergleichen Sie dieses Bild mit dem Pre-Extraktion Bild 3. Sterile Herstellung von Zell abgeleiteten ECM für Zell funktionelle Assays Wachsen einer Population von Zellen (die "Matrix-Hersteller" Zellen) auf Deckgläsern und anderen popunung (die "test" Zellen) in Standard-Kultur in einer Schale 100 mm Zellkultur für 24 Stunden mindestens. ANMERKUNG: Diese können zwei beliebige unterschiedliche adhärenten Zelltypen sein, und das experimentelle Design kann die Transfektion von einer oder beiden Zellpopulationen umfassen eine fluoreszenzmarkierte ECM-Protein zu exprimieren. In einer laminaren Strömungshaube, wie für die Zellkultur verwendet wird , herzustellen sterile Lösungen von PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+, 20 mM Ammoniumhydroxid (siehe Schritt 1.3) und deionisiertes H 2 O , indem jeweils durch ein steriles 0,2 Passieren um-Filter in eine geeignete sterile Behälter. sterile Technik Pflege, vorsichtig waschen die "Matrix-Hersteller" Zellen auf Deckgläsern dreimal mit sterilem PBS (siehe Schritt 1.2). Entfernen Sie die PBS durch Absaugen mit einer sterilen Pipette und entsorgen sie in einem geeigneten flüssigen Abfallbehälter. In 20 mM sterile Ammoniumhydroxid (3 ml / 100-mm-Schale) und brüten sie für 5 min mit in Abständen zu schaukeln. In großen Mengensterilem deionisiertem H 2 O in die "Matrix – Hersteller" Schale, mindestens 20 ml pro 100 – mm – Schale, mit Schaukeln, und das Zelllysat in einen geeigneten Abfallbehälter ausleeren. Wiederholen Sie Schritt 3.5 noch viermal die vollständige Entfernung des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. HINWEIS: Das ECM abgelegt durch die "Matrix-Hersteller" Zellen auf den Deck liefert dann eine sterile ECM für funktionelle Assays mit irgendwelchen Testzellen von Interesse. Inkubieren der Testzellen aus der Zell Lager-Schale mit 1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung pro 100 mm Schale (von 0,05% w / v Trypsin und 0,02% w / v EDTA in Hanks balancierter Salzlösung), bis die Testzellen von der Schale abgelöst werden . In Zellmedium Zentrifugation der Testzellen bei 400 × g für 5 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der Testzellen in frisches, steriles Medium und zählen sie in einem Hämozytometer. Platte, die eine entsprechende Anzahl dieser Testzellen auf die sterile, isoliert ECM auf coverslips. Kultur sie in der entsprechenden Zelle Medium für 2-3 h, oder für die Zeitdauer für die Versuchsplanung erforderlich. Um die Organisation des Aktin-Zytoskelett untersuchen, fixieren die Testzellen in 2% PFA und färben sie mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -phalloidin (Anregung = 490 nm und Emission = 525 nm) sichtbar zu machen F-Actin und mit 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindol (DAPI; Anregung = 358 nm und Emission = 461 nm) , um die Kerne 11 zu visualisieren. HINWEIS: Vergleichen Sie die Morphologie und die Aktin-Organisation in den Test auf heterologen Zellen abgeleiteten ECM mit Testzellen auf ihre eigenen ECM plattiert plattierten Zellen. 4. Isolierung von ECM für SDS-PAGE, Immunblot-Analyse oder Proteomics Wachsen anhaftenden Zellen von Interesse auf 100 mm Zellkulturschalen (5 bis 10 Gerichte für die Proteomik oder 1-2 Gerichte für Immunoblotting) für 24-96 h, je nach Zelltyp, Sekretion und Ablagerung von ECM zu ermöglichen. Entfernen Sie die Zellen als Beschribed in Schritten von 1,1 bis 1,5. Kippen Sie jede Platte in einem Winkel zu entwässern Rest H 2 O an den Boden der Schale und vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden H 2 O mit einem p200 pipettieren , bis die Platte vollständig trocken ist. Parallel Wärme SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM Dithiothreitol (DTT) bis 95 ° C für 2 min ein Heizblock verwendet, und dann zu der Platte hinzuzufügen. 200 & mgr; l Probenpuffer pro 100 mm Platte ist geeignet für Proben, die durch Immunoblot untersucht werden. Bis ECM durch Massenspektrometrie analysiert, erzielen eine konzentrierte Probe durch die SDS-PAGE-Probenpuffer von der Schale zu sammeln (wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben, weiter unten), wieder Erhitzen auf 95 ° C, und unter Verwendung des gleichen Aliquots in 2-3 zusätzliche Platten. Verwenden Sie einen Zellschaber, um gründlich die ECM von der Schüssel kratzen, um sicherzustellen, dass alle Bereiche der Schale gekratzt wurden. Mit dem Zellschaber, sammeln die Probe auf einer Seite der Schale und nehmen Sie sie mit einem 200& mgr; l-Pipettenspitze in ein Rohr. Die zurückbleibenden SDS-PAGE-Probenpuffer Extrakt aus der Zellschaber Spitze in die Röhre um den Verlust von ECM-Material zu minimieren. Für eine konzentrierte Probe erneut erhitzen die gleiche SDS-PAGE-Probenpuffer Aliquot auf 95 ° C und wiederverwenden es über 2-3 zusätzliche Platten. Lösen Sie die ECM – Proteine durch SDS-PAGE 12, unter Verwendung von entweder 7% oder 4-7% Steigung Polyacrylamidgelen. HINWEIS: Es ist bequem vorgefärbten Proteinmarker zu verwenden. Um die Auflösung der hochmolekularen ECM-Proteine ​​erhöhen, verlängern die Gel Laufzeit, so dass die 37 kDa Molekulargewichtsmarker verläuft in der Nähe der Unterseite des Gels und Molekulargewichtsmarker <37 kDa haben das Gel ablaufen. Für Proteomanalyse von ECM-Proteine, färben das Gel mit einem Protein-Färbung und ein Bild aufzunehmen. Schneiden Sie Bänder von Interesse aus dem Gel, verdauen sie mit Trypsin und analysieren sie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) -Masse Spektrometrie <sup> 13. Alternativ kann für eine umfassendere Analyse des ECM – Extrakt und die gesamte Probe zu analysieren, um das Gel Spur in Abschnitte schneiden, verdauen sie mit Trypsin und führen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) 14. Alternativ 15 Immunoblotting übertragen Proteine aus dem SDS-PAGE – Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran bei 15 V für mindestens 1 h 10 min (Halbtrockenverfahren) , um die Übertragung der hochmolekularen ECM Proteine zu gewährleisten . Visualisieren Sie die Gesamtzahl auf die Membran übertragen Protein mit einer Ponceau S-Färbung. Nach dem Schritt 4.11 Verwenden Antikörper die Anwesenheit einzurichten , und / oder eine semi-quantitative Analyse einzelner ECM Proteine 15 machen. Blockieren der Membran mit 2% (w / v) Milch in TBS-Tween 20 (Blockierungspuffer) über Nacht bei 4 ° C. Verdünnte spezifische Antikörper gegen ECM-Proteine ​​in Blocking-Puffer und Inkubation mit der Membran für 1,5 h bei Raumtemperatur (Antikörper gegen fibronectin verdünnt 1/600 und Antikörper gegen Thrombospondin-1, verdünnt 1/150; Ergänzende Tabelle 1). Testen der Qualität der ECM Isolierung durch die gleiche Blot mit Antikörpern gegen reichlich intrazelluläre Proteine ​​erneut Sondieren wie Actin oder Tubulin (anti-Aktin verdünnt 1 / 10.000 und anti-Tubulin-1 / 5.000 verdünnt).

Representative Results

Das Protokoll, beschrieben in den Schritten 1,1-1,5 wirkt Zellen zu entfernen, und hinter der Zelle stamm ECM verlassen. Das Protokoll wurde auf COS-7-Zellen durchgeführt wird für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet und die Zellen stamm ECM wurde durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Ammoniumhydroxid – Behandlung entfernt , die Zellen wirkungsvoll , da durch den Verlust der Zellkerne und Aktin – Zytoskelett etabliert nach DAPI und Phalloidin – Färbung, bzw. (Abbildung 1). Die Extraktion der Zellen mit 2 M Harnstoff war nicht so wirksam wie Ammoniumhydroxid; Spuren von DAPI und Phalloidin-Färbung wurden nach der Behandlung festgestellt. 8 M Harnstoff hatte eine ähnliche Wirkung wie Ammoniumhydroxid (Abbildung 1). Als nächstes Zellen abgeleiteten ECM vor und nach der Behandlung Ammoniumhydroxid visualisiert wurde (Schritte von 2,1 bis 2,11). COS-7 – Zellen wurden mit einem monomeren rot fluoreszierendes Protein transfiziert (mRFP) -markierte Thrombospondin-1 C-terminalen Trimer (mRFPovTSP1C) 11 und auf einer 35 – mm – Schale mit einem gerasterten Glasbasis gewachsen. Zwei Stunden nach der Plattierung, ein geeignetes Planquadrat, das mehrere gesunde Zellen enthielt exprimieren mRFPovTSP1C wurde unter einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Ein Referenzphasenkontrastbild wurde dieser Bereich genommen, und dann Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung wurde alle 1 min für 2 h (2A) durchgeführt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das gleiche Gitterquadrat in der Schale wurde unter Phasenkontrast verlagert und dann durch Fluoreszenzmikroskopie erneut analysiert. Die Zellen waren nicht mehr in der Planquadrat, aber mRFPovTSP1C blieb innerhalb des ECM, durch Fluoreszenzmikroskopie als charakteristische puncta (2A) nachgewiesen. Jede mRFPovTSP1C in der ECM Entfernung vor der Zelle abgelagert wurde durch Vergleich der Fluoreszenzmuster prä- identifiziert und post-Entfernung von Zellen. Die fluoreszierende puncta in beiden Bildern identifiziert (Figure 2A, beispielsweise Pfeile) sind geschlossen mit dem ECM verbunden zu sein. Ammoniumhydroxid Behandlung wurde dann aus kultivierten, anhaftenden Zellen zu isolieren nativen ECM verwendet. Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das ECM wurde mit einem anti-Kollagen – I – Antikörper sondiert, die eine charakteristische fibrilläre und meshwork Färbemuster zeigten 16 (2B). Fibronectin Strukturieren wurde um feste, nicht-permeabilisierten Zellen , Ratte Chondrosarkom (RCS) und innerhalb des ECM nach der Entfernung der RCS – Zellen (2C) untersucht. Das Ammoniumhydroxid Isolierung von ECM wurde ebenfalls unter sterilen Bedingungen durchgeführt, so daß "test" Zellen auf die ECM für phänotypischen oder funktionellen Studien wieder ausplattiert werden konnten. Zum Beispiel, "test" COS-7-Zellen wurden für 2 h auf sterilem ECM plattierten von RCS-Zellen produziert, und then sie wurden fixiert, permeabilisiert, und F-Actin – Organisation von FITC-Phalloidin – Färbung im Vergleich zu COS-7 – Zellen analysiert , um ihre eigenen ECM Herstellung (Schritte 3,1-3,9) (Abbildung 3). Bei einem größeren Maßstab wurde das Verfahren verwendet ECM für biochemische Verfahren zu isolieren. Zum Beispiel wurden RCS-Zellen auf zwei 100 mm-Zellkulturschalen gezüchtet für 7 Tage, und die Prozeduren in Schritten von 4,1 bis 4,7 wurden befolgt. Proteine ​​in der Zelle stamm ECM wurden gesammelt, indem sie in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer Abkratzen und wurden durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen getrennt. Das Gel wurde Protein – gefärbt, und die vier Hauptbanden wurden jeweils isoliert und durch Massenspektrometrie (4A) analysiert. Eine Reihe von ECM – Proteinen, einschließlich Fibronectin, Thrombospondin 1 (TSP1), Thrombospondin 5 / Cartilage Oligomeric Matrix Protein (TSP5 / COMP) und Matrilin-1 identifiziert wurden (4B). Alternativ kleinere Präparate von ECM kann durch Immunoblots ausgewertet werden. Beispielsweise Zellen abgeleiteten ECM von COS-7 – Zellen ektopisch exprimieren mRFPovTSP1C durch SDS-PAGE, auf eine PVDF – Membran und sondiert für RFP mit einem Anti-Antikörper , RFP (4C) getrennt. Diese Technik ist empfindlich genug , um Unterschiede zwischen einem nativen Trimer von TSP1 (mRFPovTSP1C) und ein angelegtes Pentamer des TSP1 C-terminalen Region (mRFP-TSP-5-1C) 17 (4C) in der Abscheidung zu erkennen. Um das endogene ECM von HDF, das Vorhandensein von spezifischen Proteinen in Zelllysat oder dem isolierten ECM untersuchen wurde durch Immunoblotting untersucht. Die charakteristische ECM Proteine Fibronektin und Thrombospondin-1 wurden in der ECM festgestellt, während die intrazelluläre Proteine reichlich α-Tubulin und β-Aktin aus dem isolierten ECM (4D) nicht anwesend sind. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Abbildung 1: Vergleich der Methoden der Zellentnahme. COS-7-Zellen wurden für 96 h auf Deckgläsern mit hoher Dichte gezüchtet, in 2% PFA fixiert und in 0,5% Triton X100 permeabilisiert oder behandelt wurden, wie für die Zellentfernung angegeben. Deckgläser wurden dann mit FITC-Phalloidin gefärbt F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. Diese Zahl wird im Journal of Cell Science 11 von einer ursprünglichen Veröffentlichung geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Identifizierung von ECM – Proteine in isolierten ECM. (A) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder vonCOS-7-Zellen mRFPovTSP1C und aufgewachsen auf einer 35-mm-Schale mit einem Glasboden, gridded Basis für 2 h zum Ausdruck. Bilder vor und nach der Entfernung der Zellen durch Ammoniumhydroxid gezeigt. Die Kante des Gitters Buchstabe wird in der Phasenkontrast-Bilder mit einer gestrichelten Linie angedeutet. Weiße Pfeile zeigen Beispiele für fluoreszierende puncta, die vor und nach der Zellentnahme vorhanden waren. (B) Nachweis von Kollagen I in HDF ECM durch indirekte Immunofluoreszenz. HDF wurden für 96 h entfernt und mit Ammoniumhydroxid gezüchtet und der ECM wurde für menschliche fibrillärem Kollagen I. gefärbt, um die ECM auch allein mit FITC-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper gefärbt wurde. (C) Lokalisierung von Fibronektin rund RCS – Zellen oder in isolierten RCS ECM, wie durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. RCS-Zellen wurden für 48 h, fixiert in 2% PFA, und gefärbt für Fibronektin und mit DAPI gezüchtet. Parallel Gerichte wurden die Zellen mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt und der ECM wurde fibr gefärbtenonectin und mit DAPI. Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-Maus-IgG-Antikörper allein gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Die Verwendung von sterilem ECM für funktionelle Studien. RCS "Matrix Produzent" Zellen wurden für 48 h auf Glasplättchen gezüchtet und dann mit 20 mM Ammoniumhydroxid unter sterilen Bedingungen behandelt, um die Zellen zu entfernen. COS-7 "test" Zellen wurden 2 h auf Deckgläsern mit oder ohne isoliert RCS ECM überzogen, in 2% PFA fixiert, in 0,5% Triton X100 permeabilisiert, und gefärbt mit FITC-Phalloidin F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren . COS-7 auf RCS ECM plattierten Zellen verteilt umfangreicher und bildeten große microfilament Bündel (Beispiel siehe Pfeil) und Rand ruffles. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Identifizierung von Proteinen aus isolierter ECM durch SDS-PAGE, Massenspektrometrie oder Immunoblotting. (A) wurden RCS – Zellen für 7 Tage wachsen gelassen und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt werden ; das ECM wurde in heißer SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT abgekratzt. Die ECM-Präparat wurde unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel getrennt. Vier signifikante Banden (Pfeile 1-4) wurden durch Proteinfärbung identifiziert. (B) Proteine , die von RCS ECM Banden 1-4 wurden durch MALDI – Massenspektrometrie identifiziert. (C) COS-7 – Zellen, die entweder mRFPovTSP1C (Trimer) oder mRFP-TSP-5-1C (Pentamer) für 48 kultiviert wurden ,h und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt, und das war ECM isoliert in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT. Die ECM-Präparation wurde durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit einem anti-RFP-Antikörper sondiert. Diese Platte wird von einer ursprünglichen Veröffentlichung in Bioscience Reports geändert 17. (D) HDF wurden für 96 h gezüchtet und dann entweder mit 2% Desoxycholsäure in PBS (Zelllysat) oder mit 20 mM Ammoniumhydroxid Zellen zu entfernen. Das ECM wurde geschabt in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer. Die beiden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 10% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und mit Antikörpern sondiert, wie angegeben. In jeder Platte sind die Positionen der Molekulargewichtsmarker in kDa angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses fi anzuzeigenAbbildung.

Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Das Verfahren hat einige wichtige Schritte, die die erfolgreiche Isolierung und Analyse von ECM zu gewährleisten, die befolgt werden müssen. Beispielsweise wird Ammoniumhydroxid verwendet, um die Zellen zu entfernen, und ECM für die Analyse zu isolieren. Obwohl Ammoniumhydroxid in wässrigen Lösungen im Dunkeln stabil ist und bei Raumtemperatur gelagert werden, Flaschen muss zwischen jedem Gebrauch wieder dicht verschlossen werden. Da das Gas aus der Lösung verdampfen kann, wodurch die Konzentration zu reduzieren, haben wir eine frische Flasche beginnen alle 6-8 Wochen wird dringend empfohlen. Darüber hinaus sollte die Arbeitslösung frisch für jedes Experiment durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, dass die Zellen vollständig mit reichlichen Waschungen in entionisiertem Wasser entfernt. Wenn diese Schritte nicht ausreichend durchgeführt werden, kann Zellmaterial auf dem Teller bleiben und Downstream-Analysen verunreinigen. Wenn Zellen für 10 Tage oder länger, zusätzliches Wasser wäscht angebaut worden erforderlich sein. Es ist wichtig zu nOTE dass die isolierten ECM – Schicht im Vergleich zu den Zellen ¹¹ typischerweise sehr dünn ist, so Sorgfalt erforderlich ist , wenn das ECM während der Abbildung identifizieren. Für eine effektive Extraktion des isolierten ECM in SDS-PAGE-Probenpuffer, ist es wesentlich, daß die Probenpuffer ein Reduktionsmittel enthält. Für die wirksamste Entfernung des ECM, kochend heißen Probenpuffer verwendet werden. Für Experimente, in denen ECM Proben werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese für die Proteinfärbung oder Proteomik gelöst werden, ist es entscheidend, eine konzentrierte Probe durch Abschaben mehrere Platten-Wert von ECM in der gleichen aliquoten Probenpuffer zu erreichen.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

Die Produktion und Sekretion von ECM – Proteine können signifikant zwischen Zelltypen variieren, so Zeiträume für die Sekretion und Ablagerung von ECM sollte de novo für jeden Zelltyp bestimmt werden. Es ist auch wichtig, sich bewusst zu sein, dass ECM Zusammensetzung dynamisch in Relation t änderno Zelldichte und der Zeit in Kultur ^18. Dieser Faktor sollte berücksichtigt werden, wenn Experimente entwerfen. Natürlich ist die Auswahl eines Zelltyps für dieses Verfahren an Bedeutung, insbesondere, wenn ECM für die Analyse durch Massenspektrometrie Extraktion, die eine erhebliche Menge an Gesamt ECM-Protein erfordern.

Einschränkungen der Technik

Zellen, die sehr geringe Mengen an ECM Proteine ​​sezernieren wird zur Verwendung bei diesem Verfahren schwieriger sein. Nicht anhaftende Zellen, Kulturen 3D-Zelle oder Assays Zellinvasion sind derzeit für ECM Isolation durch dieses Verfahren nicht geeignet. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Verwendung mit Standard "2-dimensional" Zellkulturen. Weil das Ammoniumhydroxid Extraktion die Zellen vollständig entfernt, zugeordnete ECM mit den Oberseiten der Zellen und sezerniert wird, jedoch nicht vernetzt, werden ECM-Proteine ​​ebenfalls entfernt, auf der Schale verlassen eine dünne Schicht zusammengesetzt ECM von unten und um die Basen der Zellen ^11,17 </sup>. Es ist komplex zu quantifizieren, wie viel ECM wird durch die Ammoniumhydroxid-Extraktion freigesetzt, da das freigesetzte Material auch ECM-Proteine ​​enthält, die entweder vor von der Zelloberfläche zur Sekretion oder nach Aufnahme intrazellulär vorliegen.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

Die Fähigkeit, eine breite Palette von Experimenten mit isolierten ECM zu führen ist wichtig, im Rahmen der Zellbiologie und Gewebephysiologie, und es hat auch Auswirkungen auf den Gebieten der Geweberegeneration und Tissue Engineering. Das Verfahren hat Vorteile gegenüber Gele aus gereinigtem Kollagen oder andere gereinigte ECM-Proteine ​​in dass die gebildeten Zellen montieren komplexe ECM Strukturen an ihrer nativen Größe, mit nativer Vernetzungsmechanismen und mit den einzelnen ECM Proteine ​​in Verhältnissen entsprechend dem Zelltyp Herkunft. Zum Beispiel zeigte die Proteom-Studie von RCS ECM reichlich Matriline und COMP / TSP5, wie erwarteteine knorpelige ECM ^19,20 (Abbildung 4). Im Allgemeinen ist die Analyse von Zellen abgeleiteten ECM durch seine Natur als umfangreiches Netzwerkmultiprotein behindert, die in kovalenter Vernetzung und die Unlöslichkeit vieler ECM-Proteine ​​führt, und auch durch die mögliche Kontamination von ECM-Extrakte mit intrazellulären Proteinen. Ein mehrstufiges Verfahren entwickelt , um die ECM – Fraktion aus Geweben für Proteomanalyse zur Isolierung ergab 8% der ECM – Proteine in der gesamten Gruppe von Proteinen ²¹ identifiziert. Jedoch Peptide aus ECM-Proteine ​​waren 73% der gesamten Peptide identifiziert. Dieses Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM schnell und zuverlässig entfernt Zellmaterial während ECM-Proteine ​​erhalten bleibt. Dieses Verfahren kann für eine Reihe von Zelltypen und Downstream-Anwendungen verwendet werden, und erleichtert die Analyse der ECM biology und Zell-ECM-Wechselwirkungen in Zellkultur. Unsere Protokolle Detail, wie das Verfahren auf verschiedenen Ebenen angewendet werden kann, eine breite Palette von exp zu adressierenerimental Fragen in Bezug auf ECM-Organisation, Dynamik oder Zusammensetzung, sowie die funktionalen Auswirkungen der isolierten ECM auf Zellen.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

Mit Blick auf die Zukunft könnte das Verfahren für die mit 3D-Zellkulturen Verwendung angepaßt werden; dies würde ihre physiologische Relevanz erweitern. Dezellularisiertes natives Gewebe hat ein großes Potenzial als ein Gerüst für die Regeneration von verlorenen oder beschädigten Gewebes und als Alternative zur Transplantation, beispielsweise nach ²² Herzinsuffizienz. Es hat das Potenzial, die Probleme der Spender Verfügbarkeit und Immunabstoßung zu überwinden. Zukünftige Anwendungen des Verfahrens in diesem Bericht beschriebenen könnte seine Verwendung mit 3D-Zellkulturen oder Gewebe Dezellularisierung untersuchen, was den Anwendungsbereich dieses Ansatzes erhöhen würde.

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot