एक तेजी से, अलगाव, कार्यात्मक अध्ययन के लिए स्केलेबल विधि, और सेल व्युत्पन्न बाह्य मैट्रिक्स का विश्लेषण

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

पिछले कुछ दशकों में, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) एक, विविध गतिशील, और जटिल वातावरण है कि कई सेल-शारीरिक और रोग की प्रक्रिया में शामिल है के रूप में मान्यता प्राप्त हो गया है। ऊतक स्तर पर, ईसीएम सेल संकेतन, गतिशीलता, भेदभाव, angiogenesis, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, tumorigenesis, फाइब्रोसिस, आदि ^1,2 प्रभावित करती है। ईसीएम संगठन और ईसीएम निर्भर प्रक्रियाओं का अध्ययन इस प्रकार कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान के लिए व्यापक प्रभाव पड़ता है। ईसीएम रचना, संगठन, और कार्यात्मक संपत्तियों की एक यंत्रवत समझ तक पहुँचने के लिए, ईसीएम की सटीक अलगाव के लिए तरीकों की आवश्यकता है। ऊतकों ³ से अलगाव पर भरोसा ईसीएम प्रोटीन की जल्द से जल्द पहचान जबकि, संवर्धित कोशिकाओं से ईसीएम की तैयारी अब और अधिक प्रचलित हो गया है।

अलगाव और सेल व्युत्पन्न ईसीएम के विश्लेषण के दो मुख्य कारणों के लिए जटिल है। सबसे पहले, कोशिकाओं की उपस्थिति औरआईआर प्रचुर मात्रा में प्रोटीन intracellular यह मुश्किल एक असतत बाह्य संरचना के रूप में ईसीएम को अलग-थलग करने के लिए कर सकते हैं। दरअसल, कुछ ईसीएम प्रोटीन कोशिका के अंदर के साथ ही ईसीएम ⁴ में भूमिका है; इसलिए, सेल व्युत्पन्न ईसीएम से intracellular प्रोटीन के कुशल हटाने महत्वपूर्ण है अगर ईसीएम के भीतर प्रोटीन का अध्ययन सेल के अंदर उनकी भूमिकाओं के साथ भ्रमित होने की नहीं है। दूसरे, सेल व्युत्पन्न ईसीएम कई बड़े, oligomeric प्रोटीन है, जो अक्सर covalently पार से जुड़े ईसीएम विधानसभा पर हैं और इसलिए मानक डिटर्जेंट में अघुलनशील हैं से बना है। इन गुणों के निष्कर्षण और ईसीएम के आगे के विश्लेषण जटिल हो सकता है। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, एक विधि के लिए आवश्यक है कि सेलुलर घटकों से ईसीएम प्रोटीन के कुशल जुदाई में सक्षम बनाता है।

कई तरीकों या तो सेल संस्कृति या ऊतक के अर्क से ईसीएम के अलगाव के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है। इन तरीकों में से कई प्रचुर मात्रा में ईसीएम जनसंपर्क की निकासी करने के उद्देश्य से कर रहे हैंotein, ऊतकों से कोलेजन, और तटस्थ लवण ^3, अम्लीय परिस्थितियों ^5,6, या पेप्सिन ⁷ का उपयोग शामिल है। ऊतक के अर्क से कुल ईसीएम के अलगाव अक्सर ईसीएम के अलगाव से पहले ऊतक के decellularization शामिल है। उदाहरण के लिए, एक अनुक्रमिक निष्कर्षण विधि का वर्णन किया गया है कि मानव हृदय के ऊतकों ⁸ से ईसीएम को अलग कर लिया है। सबसे पहले, शिथिल बाध्य ईसीएम प्रोटीन सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) से पहले 0.5 एम NaCl के साथ निकाले गए थे कोशिकाओं को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। अंत में, शेष ईसीएम प्रोटीन 4 एम guanidine ⁸ का उपयोग कर निकाले गए थे। ईसीएम भी 8 एम यूरिया ⁹ का उपयोग decellularized नमूनों से solubilized जा सकता है। अन्य तकनीकों ऐसे deoxycholic एसिड ^{10 के} रूप ^में डिटर्जेंट, का उपयोग करें, centrifugation द्वारा घुलनशील सेल lysate से अघुलनशील ईसीएम प्रोटीन को अलग करने से पहले दोनों कोशिकाओं और ईसीएम निकालने के लिए।

अलगाव और सेल व्युत्पन्न ईसीएम इस रिपोर्ट में वर्णित के विश्लेषण के लिए विधि एक रेप्रो प्रदान करता हैसेल सामग्री को हटाने, सेल व्युत्पन्न ईसीएम कि सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस में से विश्लेषण किया जा सकता है या आगे जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए निकाले छोड़ने के लिए ducible विधि। इस विधि के किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इस तरह immunoblotting या मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या कार्यात्मक अध्ययन में पृथक ईसीएम के उपयोग के लिए के रूप में नीचे की ओर प्रक्रियाओं, के लिए बढ़ाया जा सकता है। विधि को भी वास्तविक समय में ब्याज की एक टैग प्रोटीन की ईसीएम बयान ट्रैक करने के लिए जीवित कोशिकाओं के confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक gridded, गिलास तली पकवान के उपयोग के माध्यम से हासिल की है। कुल मिलाकर, दृष्टिकोण सेल व्युत्पन्न ईसीएम और भी गुंजाइश की पहचान करने और बयान और व्यक्तिगत ईसीएम प्रोटीन की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए एक सटीक अलगाव प्रदान करता है।

Protocol

अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ कोशिकाओं के 1. हटाने उचित घनत्व पर चढ़ाना द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं को तैयार है। नोट: कोशिकाओं को किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार है कि विश्लेषण के लिए पर्याप्त ईसीएम का उत्पादन हो सकता है। यहाँ, हम COS-7 कोशिकाओं, एक अफ्रीकी ग्रीन बंदर गुर्दे fibroblast की तरह सेल लाइन है कि एसवी-40 वायरल डीएनए दृश्यों में शामिल है के उपयोग का वर्णन; आरसीएस, एक चूहे कोंड्रोसारकोमा सेल लाइन; या सामान्य मानव त्वचीय fibroblast (HDF) किशोर चमड़ी से उपभेदों। HDF मार्ग 1 से पारित होने के 8 केवल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जीवित कोशिकाओं और ईसीएम, निश्चित ईसीएम के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अध्ययन के लिए की इमेजिंग के लिए coverslips पर कोशिकाओं की थाली, या छोटे पैमाने पर कार्यात्मक assays के लिए सेल व्युत्पन्न ईसीएम की तैयारी के लिए। एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण, immunoblot, या प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए सेल संस्कृति बर्तन पर कोशिकाओं थाली। नोट: सेल संस्कृति शर्तों (प्लेट के लिए कोशिकाओं और संस्कृति के माध्यम की संख्या) सेल प्रकार पर निर्भर करेगा। थाली करने के लिए सेल नंबर की आवश्यकता होगीविशेष सेल लाइन या सेल तनाव के लिए अनुभव से स्थापित किया। एक उपयुक्त समय कोशिकाओं ईसीएम जमा करने के लिए, आम तौर पर> 16 घंटे के लिए अनुमति दें। ध्यान दें: समय अवधि सेल प्रकार पर निर्भर करेगा और अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। अगर अस्थानिक अभिव्यक्ति का आयोजन, ब्याज की ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए और ईसीएम के बयान के लिए उचित समय देते हैं। एक चिमटा हुड में, de-ionized एच 2 ओ के साथ स्टॉक समाधान 1/14 गिराए द्वारा एक उपयुक्त पोत में 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड तैयार इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने और धीरे संस्कृति के माध्यम से हटा दें। धीरे पकवान की दीवारों के खिलाफ गिरने से सीए 2/2 मिलीग्राम + बिना फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें। पकवान दो बार रॉक और एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ तरल हटा दें। दो बार अधिक दोहराएँ। एक चिमटा हुड में, प्रत्येक पकवान झुकाव और एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ कदम 1.2 से पीबीएस को हटा दें। 3 जोड़े100 मिमी पकवान प्रति अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के एमएल और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें सेते हैं। 5 मिनट ऊष्मायन अवधि के दौरान, धीरे पकवान हर मिनट आंदोलन सभी कोशिकाओं के सेल सुनिश्चित करने के लिए। कदम 1.4-1.7 भी चिमटा हुड में बाहर किया जाएगा। नोट: वैकल्पिक सेल हटाने अभिकर्मकों 2 एम या 8 एम यूरिया, जो 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ incubated हैं। De-ionized एच 2 ओ के प्रचुर मात्रा में प्रत्येक पकवान 100 मिमी पकवान प्रति कम से कम 20 एमएल कमाल के साथ, जोड़ें। हाइड्रॉक्साइड-solubilized सामग्री जो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, lysed कोशिकाओं, और de-ionized एच 2 से बना है एक हस्तांतरण विंदुक के साथ आकांक्षा हे द्वारा अमोनियम के निपटान के। तरल कचरे के लिए एक कंटेनर में इस कचरे समाधान स्थानांतरण। प्रचुर de-ionized एच में अघुलनशील ईसीएम परत धो 2 हे चार गुना अधिक सभी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड-solubilized सामग्री का पूरी तरह हटाने के लिए सुनिश्चित करें। immunofluorescence द्वारा ईसीएम की परीक्षा के लिए, 2% जोड़कर ईसीएम को ठीकparaformaldehyde (पीएफए; 100 मिमी पकवान प्रति 3 एमएल) 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर। सावधानी: पीएफए ​​त्वचा या आंख से संपर्क करें और गंभीर overexposure फेफड़ों को नुकसान, घुट, बेहोशी, या मौत का उत्पादन कर सकते हैं के मामले में बहुत ही खतरनाक है। यह केवल एक चिमटा हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहना जाना चाहिए। प्रत्येक निश्चित नमूना पीबीएस के साथ दो बार धोएं, 1.2 चरण में के रूप में, और एक उपयुक्त तरल अपशिष्ट कंटेनर में पीएफए ​​समाधान के निपटान के। यदि आवश्यक हो, उन्हें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में ईसीएम नमूने संग्रहीत करते हैं। लाइव प्रकोष्ठों के Confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा एक ईसीएम प्रोटीन की 2. ट्रैकिंग बयान एक hemocytometer के तहत कोशिकाओं की गणना। COS-7 कोशिकाओं के लिए, अभिकर्मक के लिए एक 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान पर 250,000 कोशिकाओं थाली। नोट: लाइव सेल इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं को एक वेक्टर ब्याज की ईसीएम प्रोटीन, एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रतिदीप्ति के साथ फ्रेम में जुड़े हुए एन्कोडिंग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिएNT टैग। इस लाइव सेल इमेजिंग के दौरान ब्याज की ईसीएम प्रोटीन की पहचान के लिए सक्षम है। प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैसे, 16 ज) के लिए एक उपयुक्त समय के बाद कोशिकाओं trypsin EDTA के समाधान के साथ पकवान से, और थाली ~ 150,000 कोशिकाओं इमेजिंग के लिए एक 35 मिमी gridded, गिलास तली पकवान पर हटाने के लिए, एक hemocytometer में उन्हें गिनती। कोशिकाओं के लिए 2 घंटे पुनः अनुलग्न की अनुमति है और ईसीएम बयान शुरू करने के लिए (समय अवधि सेल प्रकार पर निर्भर करेगा और अनुभव से स्थापित किया जाना चाहिए)। नोट: एक सेल माध्यम है कि फिनोल लाल को शामिल नहीं करता है, क्योंकि यह एक लाल रंग है कि छवि गुणवत्ता को प्रभावित करता दे सकते हैं का प्रयोग करें। ऊपर 2 घंटे की अवधि के दौरान एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर कक्ष और एक सीओ 2 की आपूर्ति के साथ एक confocal खुर्दबीन की स्थापना की। चैम्बर में और डिश में तापमान इमेजिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस को स्थिर करने की अनुमति दें; इस 1 घंटे तक का समय लग सकता है। कोशिकाओं 35 मिमी 30 मिनट के लिए एक फ्लोरोसेंट सेल मार्कर के साथ gridded पकवान पर चढ़ाया सेते हैं। फिर, कोशिकाओं को धोनेदो बार फिनोल लाल मुक्त संस्कृति के माध्यम इमेजिंग के लिए पहले में। नोट: एक cytoplasmic फ्लोरोसेंट मार्कर, सेल मात्रा में कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक झिल्ली को शामिल मार्कर सेल किनारों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक confocal खुर्दबीन पर 20X उद्देश्य और चरण विपरीत का उपयोग करना, एक उचित ग्रिड वर्ग है कि एक नंबर (> 3) पक्षपाती की, स्वस्थ कोशिकाओं की पहचान। 63X या 100X उद्देश्यों और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत उचित तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर चुना ग्रिड वर्ग के भीतर कोशिकाओं में चुनाव का लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें। एक z ढेर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत समय चूक इमेजिंग सेट करें। सेट "शुरू" ढेर सिर्फ सेल शरीर से ऊपर होना करने के लिए सिर्फ ईसीएम परत और "अंत" ढेर के नीचे होने के लिए। 0.3 माइक्रोन के लिए z कदम आकार और कुल में गहराई 5 से 10 माइक्रोन के बीच और करने के लिए Z मात्रा सेट, सेल के प्रकार पर निर्भर करता है। इस समय बिंदु प्रति 15-30 जेड वर्गों के बीच दे देंगे। Capturई प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत छवियों समय समय पर एक निर्धारित समय अवधि में (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी), उत्तेजना = 555 एनएम और उत्सर्जन = 584 एनएम के लिए)। उदाहरण के लिए, समय चूक सॉफ्टवेयर का उपयोग 2 मिनट से कम समय के अंतराल और 2 घंटे की अवधि निर्धारित करने के लिए। निर्धारित समय अवधि में जेड-खंड छवियों का कब्जा शुरू करने के लिए "शुरू" बटन का चयन करें। समय अवधि के अंत में, कदम 1.1-1.5 में वर्णित है, ईसीएम में ब्याज की fluorescently टैग प्रोटीन का स्थानीयकरण पुष्टि करने के लिए के रूप में, पकवान से कोशिकाओं को निकाल दें। चरण विपरीत इमेजिंग और 20x उद्देश्य का उपयोग प्रासंगिक ग्रिड वर्ग स्थानांतरित करने के लिए। 63X उद्देश्य के लिए स्विच और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत ईसीएम परत की पहचान। पूर्व निकासी की छवि के लिए इस छवि की तुलना करें सेल कार्यात्मक assays के लिए सेल व्युत्पन्न ईसीएम 3. बाँझ तैयारी coverslips और एक अन्य लोकप्रियता पर ( "मैट्रिक्स निर्माता" कोशिकाओं) कोशिकाओं में से एक जनसंख्या बढ़नेआबादी कम से कम 24 घंटे के लिए एक 100 मिमी सेल संस्कृति डिश में ( "परीक्षण" कोशिकाओं) मानक संस्कृति में। नोट: ये किसी भी दो अलग अलग पक्षपाती सेल प्रकार के हो सकते हैं, और प्रयोगात्मक डिजाइन एक fluorescently टैग ईसीएम प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक या दोनों सेल आबादी के अभिकर्मक शामिल कर सकते हैं। एक लामिना का प्रवाह हुड में, सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल के रूप में, सीए 2 बिना पीबीएस के बाँझ समाधान तैयार / 2 मिलीग्राम +, 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (1.3 चरण देखें), और डी-आयनित एच 2 ओ एक बाँझ 0.2 के माध्यम से प्रत्येक से गुजर रहा एक उपयुक्त बाँझ कंटेनर में माइक्रोन फिल्टर। बाँझ तकनीक को बनाए रखने, धीरे 'मैट्रिक्स निर्माता "कोशिकाओं coverslips पर तीन बार बाँझ पीबीएस (1.2 चरण देखें) से धो लें। एक बाँझ विंदुक के साथ पीबीएस निकालें आकांक्षा से और एक उपयुक्त तरल अपशिष्ट कंटेनर में निपटाने। 20 मिमी बाँझ अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (3 मिलीग्राम / 100 मिमी पकवान) जोड़ें और अंतराल पर कमाल के साथ 5 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं। प्रचुर मात्रा में जोड़नेबाँझ de-ionized एच के 'मैट्रिक्स निर्माता "डिश के लिए 2 हे, 100 मिमी पकवान प्रति कम से कम 20 एमएल, कमाल के साथ, और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में सेल lysate दूर डालना। दोहराएँ कदम 3.5 चार गुना अधिक अमोनियम हाइड्रॉक्साइड-solubilized सामग्री का पूरी तरह हटाने के लिए सुनिश्चित करें। नोट: ईसीएम coverslips पर 'मैट्रिक्स निर्माता "कोशिकाओं द्वारा जमा तो ब्याज की किसी भी परीक्षा कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक assays के लिए एक बाँझ ईसीएम प्रदान करता है। 100 मिमी पकवान प्रति trypsin-EDTA समाधान के 1.5 एमएल के साथ सेल के शेयर पकवान से परीक्षण कोशिकाओं को सेते (0.05% w / वी trypsin और 0.02% w / v EDTA हांक संतुलित नमक के घोल में) जब तक परीक्षण कोशिकाओं पकवान से अलग कर रहे हैं । सेल के माध्यम जोड़ें, 5 मिनट के लिए 400 XG पर परीक्षण कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला तरल हटा दें। ताजा, बाँझ माध्यम में परीक्षा कोशिकाओं resuspend और एक hemocytometer में उन्हें गिनती। coversli पर बाँझ, पृथक ईसीएम पर इन परीक्षण कोशिकाओं का एक उचित नंबर प्लेटभज। उन्हें उचित सेल के माध्यम से 2-3 घंटे के लिए, या प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक समय अवधि के लिए में संस्कृति। (FITC) -phalloidin (उत्तेजना = 490 एनएम और उत्सर्जन = 525 एनएम) कल्पना करने के लिए एफ actin और 4 के साथ actin cytoskeleton के संगठन की जांच, 2% में परीक्षण कोशिकाओं को ठीक पीएफए ​​और उन्हें fluorescein आइसोथियोसाइनेट के साथ दाग ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; उत्तेजना = 358 एनएम और उत्सर्जन = 461 एनएम) नाभिक 11 कल्पना करने के लिए। नोट: आकृति विज्ञान और परीक्षण कोशिकाओं परीक्षण कोशिकाओं को अपने स्वयं के ईसीएम पर चढ़ाया साथ heterologous सेल व्युत्पन्न ईसीएम पर चढ़ाया में actin संगठन की तुलना करें। एसडीएस पृष्ठ, immunoblot विश्लेषण, या प्रोटिओमिक्स के लिए ईसीएम की 4. अलगाव , 24-96 घंटे के लिए 100 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन (प्रोटिओमिक्स के लिए 5 से 10 व्यंजन या immunoblotting के लिए 1-2 व्यंजन) पर ब्याज की पक्षपाती कोशिकाओं को विकसित सेल प्रकार के लिए उचित रूप में स्राव और ईसीएम के बयान की अनुमति है। Descr के रूप में कोशिकाओं निकालेंकदम 1.1-1.5 में ibed। एक कोण पर एक थाली झुकाव पकवान की तह तक अवशिष्ट एच के निकास के लिए 2 हे, और ध्यान से एक P200 pipet के साथ किसी भी शेष एच 2 ओ को हटाने तक की थाली पूरी तरह से सूखा है। समानांतर में, गर्मी एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर एक गर्मी ब्लॉक का उपयोग कर 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) से युक्त है, और फिर प्लेट में जोड़ें। प्रति 100 मिमी प्लेट नमूना बफर के 200 μL उचित लिए नमूने immunoblot द्वारा जांच की जानी है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ईसीएम का विश्लेषण करने के लिए, (कदम 4.5 और 4.6, नीचे में वर्णित) पकवान से एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर इकट्ठा करके एक और अधिक केंद्रित नमूना प्राप्त करने, यह 95 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर हीटिंग, और भर में एक ही विभाज्य का उपयोग कर 2-3 अतिरिक्त प्लेटें। एक सेल खुरचनी का उपयोग अच्छी तरह से पकवान बंद ईसीएम परिमार्जन करने के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि डिश के सभी क्षेत्रों स्क्रैप किया गया है। सेल खुरचनी के साथ, डिश के एक तरफ करने के लिए नमूना इकट्ठा होते हैं और एक 200 के साथ इसे हटानेएक ट्यूब में μL विंदुक टिप। ट्यूब में सेल खुरचनी सिरे से किसी भी अवशिष्ट एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर निकालने स्थानांतरण ईसीएम सामग्री के नुकसान को कम करने के लिए। एक केंद्रित नमूना के लिए, 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एक ही एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर विभाज्य फिर से गर्मी और यह 2-3 अतिरिक्त प्लेटों भर में फिर से उपयोग करें। एसडीएस पृष्ठ 12, या तो 7% या 4-7% ढाल polyacrylamide जैल का उपयोग करके ईसीएम प्रोटीन संकल्प। नोट: यह पूर्व दाग प्रोटीन मार्कर का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है। उच्च आणविक वजन ईसीएम प्रोटीन के संकल्प को बढ़ाने के लिए, कि 37 केडीए आणविक वजन मार्कर जेल और आणविक वजन मार्कर <37 केडीए के नीचे के करीब चलाता जेल से दूर चला है समय में इस तरह के जेल चल रहा हूं। ईसीएम प्रोटीन की प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए, एक प्रोटीन दाग के साथ जेल दाग और एक छवि पर कब्जा। जेल से ब्याज की बैंड कट, उन्हें trypsin के साथ पचा, और मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption द्वारा उन्हें विश्लेषण / आयनीकरण (MALDI) -mass स्पेक्ट्रोमेट्री <sup> 13। वैकल्पिक रूप से, ईसीएम निकालने का एक और अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए और पूरे नमूना विश्लेषण करने के लिए, वर्गों में जेल लेन काट दो, उन्हें trypsin के साथ पचा, और तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) 14 प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, immunoblotting 15 के लिए, एसडीएस पृष्ठ जेल से प्रोटीन पर polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली 15 वी में कम से कम 1 घंटे 10 मिनट (अर्द्ध शुष्क विधि) के लिए उच्च आणविक वजन ईसीएम प्रोटीन के हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए स्थानांतरण । कुल प्रोटीन एक रक्तवर्ण रंग एस दाग के साथ झिल्ली को हस्तांतरित कल्पना। कदम 4.11 के बाद, एंटीबॉडी का उपयोग उपस्थिति स्थापित और / या व्यक्तिगत ईसीएम प्रोटीन 15 के एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 2% (w / v) टीबीएस बीच 20 (अवरुद्ध बफर) में दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक। बफर अवरुद्ध में ईसीएम प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी पतला और झिल्ली के साथ (मिथ्या करने के लिए कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए सेते एंटीबॉडीronectin thrombospondin -1 1/150 पतला करने के लिए 1/600 और एंटीबॉडी पतला; पूरक तालिका 1)। ऐसे actin या tubulin (एंटी-actin पतला 1 / 10,000 और विरोधी tubulin पतला 1/5000) के रूप में प्रचुर मात्रा में intracellular प्रोटीन, एंटीबॉडी के साथ ही दाग ​​फिर से जांच कर रही द्वारा ईसीएम अलगाव की गुणवत्ता का परीक्षण करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल में वर्णित 1.1-1.5 कृत्यों कदम कोशिकाओं को हटाने और सेल व्युत्पन्न ईसीएम के पीछे छोड़ने के लिए। प्रोटोकॉल COS-7 कोशिकाओं कांच coverslips पर 96 घंटे के लिए हो पर बाहर किया गया था, और सेल व्युत्पन्न ईसीएम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था। के रूप में, सेल नाभिक और actin cytoskeleton के नुकसान से स्थापित DAPI और phalloidin धुंधला, क्रमशः (चित्रा 1) के अनुसार अमोनियम हाइड्रॉक्साइड उपचार प्रभावी ढंग से कोशिकाओं को हटा दिया। 2 एम यूरिया के साथ कोशिकाओं की निकासी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के रूप में प्रभावी नहीं था; DAPI और phalloidin धुंधला के निशान उपचार के बाद पता चला रहे थे। 8 एम यूरिया अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के लिए एक समान प्रभाव (चित्रा 1) था। अगले, सेल व्युत्पन्न ईसीएम से पहले और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड उपचार के बाद कल्पना की गई थी (2.1-2.11 कदम)। COS-7 कोशिकाओं एक मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mRFP) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे -tagged thrombospondin -1 सी टर्मिनल trimer, (mRFPovTSP1C) 11 और एक gridded कांच आधार के साथ एक 35 मिमी पकवान पर हो। दो घंटे बाद चढ़ाना, एक उपयुक्त ग्रिड वर्ग है कि कई स्वस्थ mRFPovTSP1C व्यक्त कोशिकाओं निहित एक confocal खुर्दबीन के नीचे कल्पना की गई थी। एक संदर्भ चरण विपरीत छवि इस क्षेत्र के लिए लिया गया था, और उसके बाद प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग 2 एच (2A चित्रा) के लिए हर 1 मिनट बाहर किया गया था। कोशिकाओं तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग कर हटा दिया गया है, और पकवान पर एक ही ग्रिड वर्ग चरण विपरीत तहत जगह बदली थी और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उसके बाद फिर से विश्लेषण किया। कोशिकाओं नहीं रह ग्रिड वर्ग में मौजूद थे, लेकिन mRFPovTSP1C ईसीएम के भीतर बने रहे, विशेषता puncta (2A चित्रा) के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया। किसी भी mRFPovTSP1C ईसीएम सेल हटाने के लिए पूर्व में जमा प्रतिदीप्ति पैटर्न पूर्व और कोशिकाओं के पद से हटाने की तुलना द्वारा की पहचान की थी। फ्लोरोसेंट puncta दोनों छवियों में पहचान (figu2A कर रहे हैं, उदाहरण के arrowed) ईसीएम के साथ जुड़े होने का अनुमान लगाया जाता है। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड उपचार तो सुसंस्कृत, पक्षपाती कोशिकाओं से देशी ईसीएम को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मानव त्वचीय fibroblasts (HDF) 96 घंटे के लिए कांच coverslips पर बड़े हो रहे थे। प्रकोष्ठों अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग कर हटा दिया गया है, और ईसीएम एक विरोधी कोलेजन मैं एंटीबॉडी, जो एक विशेषता fibrillar और meshwork धुंधला पैटर्न 16 (चित्रा 2 बी) का प्रदर्शन के साथ जांच की गई थी। फ़ाइब्रोनेक्टिन patterning आरसीएस कोशिकाओं (चित्रा -2) को हटाने के बाद तय चारों ओर, गैर permeabilized चूहे कोंड्रोसारकोमा कोशिकाओं (आरसीएस) और ईसीएम के भीतर जांच की गई थी। ईसीएम की अमोनियम हाइड्रॉक्साइड अलगाव भी इतना है कि "परीक्षण" कोशिकाओं प्ररूपी या कार्यात्मक अध्ययन के लिए ईसीएम पर फिर से चढ़ाया जा सकता है बाँझ शर्तों के तहत बाहर किया गया था। उदाहरण के लिए, "परीक्षण" COS-7 कोशिकाओं 2 घंटे के लिए बाँझ ईसीएम आरसीएस कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, और टी पर चढ़ाया गयामुर्गी वे COS-7 के लिए अपने स्वयं ईसीएम उत्पादक कोशिकाओं (कदम 3.1-3.9) (चित्रा 3) के लिए, तय किया गया permeabilized, और FITC-phalloidin धुंधला द्वारा एफ actin संगठन के लिए विश्लेषण, तुलना में। एक बड़े पैमाने पर, विधि जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए ईसीएम को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उदाहरण के लिए, आरसीएस कोशिकाओं 7 दिनों के लिए दो 100 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन पर बड़े हो रहे थे, और कदम 4.1-4.7 में प्रक्रियाओं का पालन किया गया। सेल व्युत्पन्न ईसीएम में प्रोटीन उन्हें गर्म एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में scraping द्वारा एकत्र किए गए थे और शर्तों को कम करने के तहत एक 7% polyacrylamide जेल पर एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे। जेल प्रोटीन के लिए सना हुआ था, और चार प्रमुख बैंड प्रत्येक अलग-थलग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा -4 ए) द्वारा विश्लेषण किया गया। फ़ाइब्रोनेक्टिन सहित ईसीएम प्रोटीन, के एक नंबर, thrombospondin 1 (TSP1), thrombospondin 5 / उपास्थि oligomeric मैट्रिक्स प्रोटीन (TSP5 / COMP), और matrilin -1 की पहचान की गई है (चित्रा 4 बी)। वैकल्पिक रूप से, ईसीएम के छोटे पैमाने पर तैयारियों immunoblots द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, COS-7 कोशिकाओं ectopically व्यक्त mRFPovTSP1C एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गया था, एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित, और एक विरोधी आरएफपी एंटीबॉडी (चित्रा 4C) के साथ आरएफपी के लिए जांच से सेल व्युत्पन्न ईसीएम। यह तकनीक काफी संवेदनशील TSP1 (mRFPovTSP1C) के एक निवासी trimer और TSP1 सी टर्मिनल क्षेत्र (mRFP चम्मच-5-1C) 17 (चित्रा 4C) की pentamer एक इंजीनियर के बीच बयान में अंतर का पता लगाने के लिए है। HDF की अंतर्जात ईसीएम की जांच करने के लिए, सेल lysate या अलग ईसीएम में विशिष्ट प्रोटीन की उपस्थिति immunoblotting द्वारा जांच की गई थी। विशेषता ईसीएम प्रोटीन फ़ाइब्रोनेक्टिन और thrombospondin -1, ईसीएम में पता चला है, जबकि प्रचुर मात्रा में intracellular प्रोटीन α ट्यूबिलिन और β-actin अलग ईसीएम (चित्रा 4D) से अनुपस्थित थे। <p class="jove_content" fo:keईपी together.within-पेज = "1"> चित्रा 1: सेल को हटाने के तरीके की तुलना। COS-7 कोशिकाओं coverslips पर 96 घंटे, 2% पीएफए ​​में तय करने के लिए उच्च घनत्व में बड़े हो रहे थे, और 0.5% ट्राइटन X100 में permeabilized, या के रूप में सेल को हटाने के लिए संकेत दिया जाता था। Coverslips तो नाभिक कल्पना करने के लिए एफ actin और DAPI कल्पना करने के लिए FITC-phalloidin साथ दाग रहे थे। स्केल बार = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा सेल विज्ञान 11 के जर्नल में एक मूल प्रकाशन से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2: पृथक ईसीएम में ईसीएम प्रोटीन की पहचान। (ए) के पहले चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति छवियोंCOS-7 कोशिकाओं mRFPovTSP1C व्यक्त करने और 2 घंटे के लिए एक गिलास तली, gridded आधार के साथ एक 35 मिमी पकवान पर हो। छवियों से पहले और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा कोशिकाओं को हटाने के बाद दिखाए जाते हैं। ग्रिड पत्र के किनारे एक बिंदीदार रेखा के साथ चरण विपरीत छवियों में संकेत दिया है। व्हाइट तीर है कि पहले और सेल हटाने के बाद उपस्थित थे फ्लोरोसेंट puncta के उदाहरण से संकेत मिलता है। (ख) मैं अप्रत्यक्ष immunofluorescence द्वारा HDF ईसीएम में कोलेजन की जांच। HDF 96 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ हटा दिया, और ईसीएम मानव तंतुमय कोलेजन आई ईसीएम भी अकेले FITC संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था के लिए सना हुआ था। (सी) आरसीएस कोशिकाओं के आसपास या अलग-थलग आरसीएस ईसीएम भीतर फ़ाइब्रोनेक्टिन का स्थानीयकरण, के रूप में अप्रत्यक्ष immunofluorescence द्वारा पता लगाया। आरसीएस कोशिकाओं 48 घंटे, 2% पीएफए ​​में तय हो गई है, और fibronectin के लिए और DAPI के साथ दाग रहे थे। समानांतर बर्तन में, कोशिकाओं 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ हटा दिया गया है और ईसीएम FIBR के लिए सना हुआ थाonectin और DAPI के साथ। कोशिकाओं को भी FITC संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी अकेले एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3: कार्यात्मक अध्ययन के लिए बाँझ ईसीएम का प्रयोग करें। आरसीएस 'मैट्रिक्स निर्माता "कोशिकाओं कांच coverslips पर 48 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे और फिर बाँझ शर्तों के तहत 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ इलाज किया कोशिकाओं को हटाने के लिए। COS-7 "परीक्षण" कोशिकाओं के साथ या 2 घंटे के लिए अलग आरसीएस ईसीएम बिना coverslips पर चढ़ाया गया, 2% पीएफए ​​में तय हो, 0.5% ट्राइटन X100 में permeabilized, और एफ actin और DAPI नाभिक कल्पना करने के लिए कल्पना करने के लिए FITC-phalloidin साथ दाग । COS-7 कोशिकाओं आरसीएस ईसीएम पर चढ़ाया अधिक बड़े पैमाने पर फैला हुआ है और बड़े microfilament बंडलों (उदाहरण के arrowed) और किनारे एक प्रकार की मछली का गठनलेस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: एसडीएस पृष्ठ, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या immunoblotting द्वारा पृथक ईसीएम से प्रोटीन की पहचान। (ए) आरसीएस कोशिकाओं 7 दिनों के लिए हो गई है और 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ हटा दिया गया था; ईसीएम गर्म एसडीएस पृष्ठ नमूना 100 मिमी डीटीटी युक्त बफर में ऊपर scraped किया गया था। ईसीएम तैयारी की स्थिति को कम करने के तहत एक 7% polyacrylamide जेल पर एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गया था। चार महत्वपूर्ण बैंड (तीर 1-4) प्रोटीन धुंधला द्वारा की पहचान की गई। आरसीएस ईसीएम बैंड 1-4 से (बी) प्रोटीन MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की गई। (सी) COS-7 कोशिकाओं को व्यक्त या तो mRFPovTSP1C (trimer) या mRFP चम्मच-5-1C (pentamer) 48 के लिए सुसंस्कृत थेएच और 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ हटा दिया, और ईसीएम था गर्म एसडीएस पृष्ठ नमूना 100 मिमी डीटीटी युक्त बफर में अलग। ईसीएम तैयारी को कम करने की स्थिति, एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित तहत एक 7% polyacrylamide जेल पर एसडीएस पृष्ठ से अलग कर दिया, और एक विरोधी आरएफपी एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। इस पैनल बायोसाइंस रिपोर्ट 17 में एक मूल प्रकाशन से संशोधित किया गया है। (डी) HDF 96 घंटे के लिए हो गई है और उसके बाद कोशिकाओं को हटाने के लिए या तो पीबीएस में 2% deoxycholic एसिड (सेल lysate) के साथ या 20 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ इलाज किया गया। ईसीएम गर्म एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में स्क्रैप की गई थी। दो भागों एसडीएस पृष्ठ से संकेत के रूप में, को कम करने की स्थिति, एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित के तहत एक 10% polyacrylamide जेल पर अलग, और एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे। प्रत्येक पैनल में, आणविक वजन मार्करों के पदों पर केडीए में संकेत कर रहे हैं। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure।

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

विधि कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सफल अलगाव और ईसीएम के विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए है। उदाहरण के लिए, अमोनियम हाइड्रॉक्साइड कोशिकाओं को दूर करने और विश्लेषण के लिए ईसीएम को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि अमोनियम हाइड्रॉक्साइड अंधेरे में जलीय समाधान में स्थिर है और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है, बोतलें कसकर प्रत्येक उपयोग के बीच फिर से सील किया जाना चाहिए। क्योंकि गैस समाधान से लुप्त हो सकता है, इस प्रकार की एकाग्रता को कम करने, हम दृढ़ता से एक ताजा बोतल हर 6-8 सप्ताह के शुरू करने की सिफारिश। इसके अलावा, काम समाधान एक प्रयोग के लिए हौसले से किया जाना चाहिए। यह भी जरूरी है कि कोशिकाओं को पूरी तरह de-ionized पानी में प्रचुर washes के साथ हटा दिया जाता है। इन चरणों का पर्याप्त रूप से प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं, सेलुलर सामग्री पकवान पर बने हुए हैं और नीचे की ओर विश्लेषण दूषित हो सकता है। कोशिकाओं को 10 दिनों या उससे अधिक समय के लिए विकसित किया गया है, तो अतिरिक्त पानी washes जरूरत हो सकती है। यह n करने के लिए महत्वपूर्ण हैOTE कि पृथक ईसीएम परत आम तौर पर ¹¹ कोशिकाओं की तुलना में बहुत पतली है, तो ध्यान जब इमेजिंग के दौरान ईसीएम की पहचान करने की जरूरत है। एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में अलग ईसीएम के प्रभावी निकासी के लिए, यह जरूरी है कि नमूना बफर एक एजेंट को कम करने में शामिल है। ईसीएम के सबसे प्रभावी हटाने के लिए, उबलते गर्म नमूना बफर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रयोगों में जो ईसीएम नमूने प्रोटीन धुंधला या प्रोटिओमिक्स के लिए एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल हो जाएगा के लिए, यह नमूना बफर का एक ही विभाज्य में ईसीएम के कई प्लेटों के लायक scraping द्वारा एक केंद्रित नमूना हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

संशोधन और समस्या निवारण

उत्पादन और ईसीएम प्रोटीन का स्राव प्रकार की कोशिकाओं के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं, इसलिए स्राव और ईसीएम के बयान के लिए समय अवधि निर्धारित किया जाना चाहिए नए सिरे से प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए। यह भी पता होना जरूरी है कि ईसीएम रचना संबंध टी में गतिशील रूप से बदल जाएगाओ सेल घनत्व और संस्कृति ¹⁸ में समय है। जब प्रयोगों को डिजाइन इस पहलू को ध्यान में रखा जाना चाहिए। जाहिर है, इस विधि के लिए एक सेल प्रकार का चयन विशेष रूप से जब मास स्पेक्ट्रोमेट्री, जो कुल ईसीएम प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में आवश्यकता हो सकती द्वारा विश्लेषण के लिए ईसीएम निकालने, महत्वपूर्ण है।

तकनीक की सीमाएं

प्रकोष्ठों कि ईसीएम प्रोटीन का स्तर बहुत कम छिपाना इस विधि के साथ उपयोग के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण होगा। गैर पक्षपाती कोशिकाओं, 3 डी सेल संस्कृतियों, या सेल आक्रमण assays इस विधि से ईसीएम अलगाव के लिए वर्तमान में अनुपयुक्त हैं। विधि मानक "2-आयामी" सेल संस्कृतियों के साथ उपयोग के लिए सबसे उपयुक्त है। क्योंकि अमोनियम हाइड्रॉक्साइड निकासी कोशिकाओं को पूरी तरह, ईसीएम कोशिकाओं के ऊपरी पक्षों के साथ जुड़ा हुआ है और स्रावित निकालता है, लेकिन गैर-पार से जुड़े, ईसीएम प्रोटीन भी हटा रहे हैं, नीचे से और ठिकानों के आसपास इकट्ठे ईसीएम की एक पतली परत पकवान पर छोड़ने कोशिकाओं ^11,17 के </sup>। यह मात्रा ठहराना कितना ईसीएम, अमोनियम हाइड्रॉक्साइड निष्कर्षण द्वारा जारी की है जारी की सामग्री भी ईसीएम प्रोटीन है कि या तो स्राव करने के लिए या कोशिका की सतह से तेज होने के बाद से पहले intracellular हैं शामिल हैं क्योंकि जटिल है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

पृथक ईसीएम के साथ प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला आयोजित करने की क्षमता कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान के संदर्भ में महत्वपूर्ण है, और यह भी ऊतक उत्थान और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र के लिए निहितार्थ हैं। विधि शुद्ध कोलेजन या उस में अन्य शुद्ध ईसीएम प्रोटीन से कोशिकाओं का गठन मूल निवासी पार से जोड़ने तंत्र के साथ और मूल के सेल प्रकार के उचित अनुपात में मौजूद अलग-अलग ईसीएम प्रोटीन के साथ, उनके मूल आकार में जटिल ईसीएम संरचनाओं को इकट्ठा जैल से अधिक लाभ है। उदाहरण के लिए, आरसीएस ईसीएम की प्रोटिओमिक अध्ययन, प्रचुर मात्रा में matrilins और कंप्यूटर अनुप्रयोग / TSP5 प्रदर्शन के रूप में के लिए उम्मीदएक उपास्थि ईसीएम ^19,20 (चित्रा 4)। सामान्य में, सेल व्युत्पन्न ईसीएम के विश्लेषण के लिए एक व्यापक, बहु प्रोटीन नेटवर्क है कि सहसंयोजक तिर्यक में यह परिणाम है और कई ईसीएम प्रोटीन की जटिलता के रूप में अपनी प्रकृति के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहा है, और यह भी ईसीएम के संभावित संदूषण से intracellular प्रोटीन के साथ निकालता है। प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए ऊतकों से ईसीएम अंश को अलग करने के लिए बनाया गया एक बहु कदम प्रक्रिया ²¹ पहचान प्रोटीन की कुल सेट में ईसीएम प्रोटीन के 8% झुकेंगे। हालांकि, ईसीएम प्रोटीन से पेप्टाइड्स की पहचान की कुल पेप्टाइड्स के 73% थे। अलगाव और सेल व्युत्पन्न ईसीएम के विश्लेषण के लिए इस विधि को तेजी से और मज़बूती से ईसीएम प्रोटीन बनाए रखने whilst सेलुलर सामग्री को हटा। इस विधि प्रकार की कोशिकाओं और नीचे की ओर आवेदनों की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सेल संस्कृति में ईसीएम जीव विज्ञान और सेल ईसीएम बातचीत के विश्लेषण की सुविधा। हमारे प्रोटोकॉल विस्तार कैसे विधि विभिन्न पैमाने पर लागू किया जा सकता विस्तार के एक विस्तृत रेंज को संबोधित करने केईसीएम संगठन, गतिशीलता, या रचना के संबंध में erimental सवाल है, और कोशिकाओं पर पृथक ईसीएम के कार्यात्मक प्रभाव है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

भविष्य को देखते हुए, विधि 3 डी सेल संस्कृतियों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; यह अपनी शारीरिक प्रासंगिकता का विस्तार होगा। Decellularized देशी ऊतक खो दिया है या क्षतिग्रस्त ऊतकों के उत्थान के लिए और इस तरह के दिल की विफलता के बाद ²² के रूप में प्रत्यारोपण के लिए एक विकल्प के रूप में एक पाड़ के रूप में महान क्षमता है। यह संभावित दाता उपलब्धता और immunorejection की समस्याओं को दूर करने के लिए है। विधि इस रिपोर्ट में वर्णित के भविष्य अनुप्रयोगों 3 डी सेल संस्कृतियों या ऊतक decellularization है, जो आगे इस दृष्टिकोण के दायरे में वृद्धि होगी साथ इसके उपयोग की जांच कर सकता है।

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot