يتم جمع متتالية المقاطع البرد لتمكين التطبيقات النسيجية والإثراء من الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. يتم الحصول على جودة عالية RNA 20-30 ملغ من cryosections والقياسات المجمعة تتم مقارنة مباشرة عبر تطبيقات.
مع هذا الأسلوب، يتم جمع cryosections التوالي لتمكين كل من التطبيقات المجهري لأنسجة الأنسجة والإثراء من الحمض النووي الريبي للتعبير الجينات باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. عادة، فإنه يمثل تحديا لتحقيق التجانس كافية من عينات صغيرة العضلات والهيكل العظمي وذلك لأن كميات المخزن المؤقت قد تكون منخفضة للغاية بالنسبة لتطبيقات طحن كفاءة، ولكن دون تعطيل الميكانيكية كافية، والهندسة المعمارية الأنسجة الكثيفة من اختراق حدود العضلات من الكواشف العازلة، مما تسبب في نهاية المطاف انخفاض العائد الحمض النووي الريبي. باتباع بروتوكول ذكرت هنا، يتم جمع 30 ميكرون أقسام وتجميع السماح cryosectioning والتجانس إبرة لاحق لتعطيل ميكانيكيا العضلات، وزيادة مساحة السطح المعرض للاختراق العازلة. القيود الأساسية للتقنية هي أنه يتطلب ناظم البرد، وأنه هو نسبيا منخفضة الإنتاجية. ومع ذلك، يمكن الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي عينات صغيرة من م المجمعةcryosections uscle، مما يجعل هذه الطريقة في متناول العديد من العضلات والهيكل العظمي المختلفة والأنسجة الأخرى. التحليلات وعلاوة على ذلك، تمكن هذه التقنية مطابقة (على سبيل المثال، التشريح الأنسجة والجينات) من المناطق المجاورة في العضلات والهيكل العظمي واحدة بحيث القياسات يمكن مقارنتها مباشرة عبر تطبيقات للحد من عدم اليقين التجريبي وللحد من التجارب على الحيوانات تنسخي اللازمة لمصدر الأنسجة صغيرة ل تطبيقات متعددة.
والهدف من هذه التقنية هو جعل التحليلات التجريبية متعددة من طرائق مختلفة، مثل الأنسجة والتعبير الجيني، يمكن الوصول إليها من صغيرة الهيكل العظمي الأنسجة مصدر عضلة واحدة. تطبيقات المجهر هي الأكثر حساسية لعينة طرق المحافظة، والتي يجب أن تسيطر عليها بعناية للحد من تشكيل التحف الكريستال الجليد أثناء الحفظ بالتبريد. وهكذا، ويستند تطوير الأسلوب على الأمامية الظنبوبي (TA) في العضلات المجمدة مغطاة جزئيا مع تضمين الراتنج في السائل حمام 2-methylbutane تبريد النيتروجين -140 ° C كمادة مصدر لكلا المجهري المناعي والتعبير الجيني التحليلات.
الحاجة إلى استخدام نفس المادة المصدر لنهج تقنية متنوعة ذات أهمية خاصة للتجارب القائم على حقن في العضل حيث تمثل العضلات اليمنى واليسرى ظروف مختلفة، واحد المجموعتين الضابطة والتجريبية واحد. على سبيل المثال، في دراسات تجديد العضلات، مو واحديتم حقن scle مع المادة السامة أن يسبب تلف الأنسجة على نطاق واسع في حين تخدم العضلات المقابل كعنصر تحكم حقن المركبة 1. وبالمثل، دراسات العلاج الجيني للاضطرابات العضلات وعادة ما تبدأ مع المصادقة على ناقلات العلاج الجيني عن طريق الحقن العضلي يمكن مقارنتها مع ناقلات فارغة، ناقلات لا علاقة لها أو السيطرة على السيارة على الجانب المقابل 2. وبالتالي، فإنه ليس من الممكن أن مصدر كل عضلة TA إلى تطبيق آخر.
استراتيجيات مشتركة للتعامل مع هذه المسألة هي: ط) لاستخدام مجموعة مختلفة من العضلات لكل تطبيق، ب) لاستخدام الفئران إضافية، أو ج) لقطع قطعة من العضلات لكل تطبيق. ومع ذلك، اختلافات جوهرية بين المجموعات العضلية تجعل من الصعب مقارنة البيانات من التطبيقات منفصلة، والحيوانات إضافية تزيد النفقات ولها ما يبررها سيئة في حالة وجود بدائل أخرى. تقسيم العضلات بعد تشريح لمصدر التطبيقات المختلفة هو الخيار الأفضل طالعديد ن الحالات. ومع ذلك، فإن قطع العضلات وغالبا ما تكون صغيرة جدا لاستخدام سحق تحت النيتروجين السائل أو تقنيات طحن الميكانيكية لتجانس 2-5. كما العضلات هي الأنسجة الهيكلية للغاية معبأة مع مصفوفة ومقلص البروتينات خارج الخلية، وعدم كفاية التجانس الميكانيكية يؤدي إلى العائد المنخفض من الحامض النووي لاحق، RNA أو البروتين. طريقة مفصلة هنا يسمح كميات صغيرة من نسيج العضلات مصدر واحد للاستخدام في تطبيقات متعددة، وإدراج cryosectioning وإبرة سحن يحسن تجانس الميكانيكية لتحسين العائد الحمض النووي الريبي.
لتحقيق أفضل النتائج مع هذا الأسلوب، والحفاظ على تضمين الراتنج يقتصر على الثلث السفلي أو نصف العضلات أثناء الحفظ بالتبريد الأنسجة بسبب الراتنج الزائد سيتباطأ جمع cryosections المجمعة وقد يزيد تضمين تلوث الراتنج في عزل الحمض النووي الريبي. أيضا، عناية فائقة خلال التجانس إ?…
The authors have nothing to disclose.
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |