Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l'espressione genica e analisi istologiche
Summary
Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 – 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.
Abstract
Con questo metodo, criosezioni consecutivi sono raccolti per permettere alle applicazioni di microscopia per istologia dei tessuti e l'arricchimento di RNA per l'espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. In genere, è difficile da ottenere una adeguata omogeneizzazione dei piccoli campioni del muscolo scheletrico a causa volumi buffer può essere troppo bassa per le applicazioni di macinazione efficiente, ma senza sufficiente rottura meccanica, l'architettura del tessuto denso di limiti muscolari penetrazione dei reagenti tampone, in ultima analisi, causando bassa resa di RNA. Seguendo il protocollo qui riportato, 30 sezioni micron sono raccolti ed aggregati permettendo criosezionamento e successiva omogeneizzazione ago per interrompere meccanicamente il muscolo, aumentando l'area superficiale esposta per la penetrazione buffer. I limiti principali della tecnica sono che richiede un criostato, ed è relativamente ridotto. Tuttavia, RNA di alta qualità può essere ottenuto da piccoli campioni di m poolcriosezioni uscle, rendendo questo metodo accessibile per molti muscoli scheletrici diversi e altri tessuti. Analisi Inoltre, questa tecnica permette abbinato (ad esempio, istopatologia tessuto e di espressione genica) dalle regioni adiacenti di un singolo muscolo scheletrico in modo che le misurazioni sono direttamente confrontabili tra applicazioni per ridurre l'incertezza sperimentale e per ridurre gli esperimenti su animali replicativi necessario fonte un piccolo tessuto per la applicazioni multiple.
Introduction
L'obiettivo di questa tecnica è quello di rendere più analisi sperimentali diverse modalità, quali l'espressione genica e istologia, accessibili da un unico piccolo tessuto d'origine muscolo scheletrico. applicazioni Microscopia sono più sensibili al campione metodi di conservazione, che devono essere controllati con attenzione per limitare la formazione di manufatti cristalli di ghiaccio durante crioconservazione. Pertanto, lo sviluppo del metodo si basa sulla tibiale anteriore (TA) muscolare congelati parzialmente coperto di incorporamento di resina in un raffreddato con azoto liquido vasca 2-metilbutano -140 ° C come materiale sorgente per immunofluorescenza e analisi dell'espressione genica.
La necessità di utilizzare lo stesso materiale di base per diversi approcci tecnici è particolarmente importante per gli esperimenti di iniezione a base intramuscolare cui i muscoli a destra e sinistra rappresentano differenti condizioni, una sperimentale e uno di controllo. Ad esempio, in studi di rigenerazione muscolare, uno muSCLE viene iniettato con una tossina provocare danni ai tessuti diffusa mentre il muscolo controlaterale serve come un controllo del veicolo iniettato 1. Analogamente, studi di terapia genica per disturbi muscolari tipicamente iniziano con la convalida del vettore terapia genica mediante iniezione intramuscolare da confrontare con vettore vuoto, vector estranei o controllo del veicolo sul lato controlaterale 2. Pertanto, non è possibile reperire ogni muscolo TA a un'altra applicazione.
Le strategie comuni per affrontare questo problema sono i seguenti: i) per utilizzare un gruppo muscolare diverso per ogni applicazione, ii) di utilizzare topi aggiuntivi, o iii) per tagliare un pezzo di muscolo per ogni applicazione. Tuttavia, le differenze sostanziali tra i gruppi muscolari rendono difficile il confronto dei dati da applicazioni separate, e altri animali aumentano spese e sono scarsamente giustificata se esistono altre alternative. Dividendo il muscolo dopo la dissezione di procurarsi diverse applicazioni è il migliore che l'opzionen molti casi. Tuttavia, i pezzi muscolari sono spesso troppo piccole per utilizzare polverizzazione sotto azoto liquido o tecniche di macinazione meccanica per omogeneizzazione 2-5. Come il muscolo è un tessuto altamente strutturale ricco di proteine della matrice extracellulare e contrattili, inadeguata omogeneizzazione meccanica porta ad una bassa resa di successive DNA, RNA o proteine. Il metodo descritto qui consente di piccole quantità di tessuto da un muscolo fonte per l'utilizzo in diverse applicazioni, e l'inclusione di criosezionamento e l'ago triturazione migliora omogeneizzazione meccanica per una migliore resa RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere i migliori risultati con questo metodo, tenere embedding resina limitato al terzo inferiore o mezza del muscolo durante la crioconservazione di tessuto, perché la resina in eccesso rallenta la raccolta dei criosezioni pool e può aumentare l'incorporamento contaminazione resina nell'isolamento dell'RNA. Inoltre, attenzione durante dell'ago omogeneizzazione è importante per ottimizzare il rendimento e minimizzare la probabilità di intasamento dell'ago. Il protocollo può essere modific…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
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