Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas
Summary
Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 – 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.
Abstract
Com este método, criosecções consecutivos são coletadas para permitir que ambas as aplicações de microscopia para a histologia do tecido e enriquecimento do RNA para a expressão do gene usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. Normalmente, é um desafio para alcançar a homogeneização adequada de amostras de músculo esquelético pequenas porque os volumes de tampão pode ser muito baixa para aplicações de moagem eficientes, mas sem ruptura mecânica suficiente, a arquitetura do tecido denso de limites musculares penetração de reagentes tampão, em última análise, causando baixo rendimento RNA. Seguindo o protocolo aqui relatado, 30 um secções são recolhidas e combinadas permitindo cryosectioning e subsequente homogeneização agulha para mecanicamente perturbar o músculo, aumentando a área de superfície exposta para a penetração tampão. As principais limitações da técnica é que ela exige um criostato, e é relativamente baixa taxa de transferência. No entanto, o RNA de alta qualidade pode ser obtido a partir de pequenas amostras de m reunidascriocortes uscle, tornando este método acessível para muitos músculos esqueléticos e de outros tecidos diferentes. Análises Além disso, esta técnica permite combinados (por exemplo, exame histopatológico dos tecidos e expressão de genes) de regiões adjacentes de um único músculo esquelético de modo que as medições podem ser diretamente comparados entre aplicativos para reduzir a incerteza experimental e para reduzir as experiências com animais replicativas necessárias para obter uma pequena de tecido para múltiplas aplicações.
Introduction
O objetivo desta técnica é fazer várias análises experimentais por diferentes modalidades, como histologia e expressão gênica, acessíveis a partir de um único tecido esquelético pequena fonte muscular. Microscopia aplicações são as mais sensíveis para amostrar os métodos de conservação, que devem ser cuidadosamente controlados para limitar a formação de artefactos de cristais de gelo durante a criopreservação. Assim, o desenvolvimento do método baseia-se no músculo tibial anterior (TA) músculo congelado parcialmente coberto com a incorporação de um banho de resina em 2-metilbutano -140 ° C líquido arrefecido com azoto como o material fonte para microscopia de imunofluorescência e a expressão do gene análises.
A necessidade de utilizar o mesmo material de origem de diversas abordagens técnicas é particularmente importante para as experiências com base em injecção intramuscular em que os músculos para a esquerda e direita representam condições diferentes, um experimental e um controlo. Por exemplo, em estudos de regeneração muscular, um muLECS é injectado com uma toxina para causar dano tecidual generalizada enquanto o músculo contralateral serve como controlo injectados com veículo 1. De igual modo, os estudos de terapia génica para doenças musculares começam tipicamente com a validação do vector de terapia genética por injecção intramuscular para ser comparado com o vector vazio, ou vector não relacionado de controlo de veículo no lado contralateral 2. Portanto, não é possível a fonte de cada músculo TA para uma aplicação diferente.
As estratégias comuns para lidar com este problema são: i) a utilização de um grupo muscular diferente para cada aplicação, ii) para usar camundongos adicionais, ou iii) para cortar um pedaço do músculo para cada aplicação. No entanto, diferenças significativas entre os grupos musculares tornam difícil comparar os dados de aplicativos separados, e os animais adicionais aumentam despesa e são mal justifica se existem outras alternativas. Dividindo o músculo após a dissecação, a fonte aplicações diferentes é a melhor opção in muitos casos. No entanto, os pedaços de músculo são muitas vezes demasiado pequena para usar pulverização sob azoto líquido ou técnicas de trituração mecânica para homogeneização 2-5. Como o músculo é um tecido altamente estrutural embalado com proteínas da matriz extracelular e contráteis, homogeneização mecânica inadequada leva a um baixo rendimento de DNA posterior, RNA ou proteína. O método descrito aqui permite que pequenas quantidades de tecido de um músculo fonte para uso em múltiplas aplicações, ea inclusão de cryosectioning e agulha trituração melhora homogeneização mecânica para um melhor rendimento de RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obter os melhores resultados com este método, manter a incorporação de resina restrita ao terceiro ou inferior a metade do músculo durante a criopreservação de tecido porque o excesso de resina vai retardar a recolha dos criocortes reunidas e pode aumentar a incorporação de contaminação resina no isolamento de ARN. Além disso, muita atenção durante a homogeneização da agulha é importante para maximizar o rendimento e minimizar a probabilidade de entupimento da agulha. O protocolo pode ser modificado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
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