Cryosectioning av tilstøtende områder av et enkelt muse Skeletal Muscle for Gene Expression og histologiske analyser

Summary

Sammenhengende kryo-seksjoner er samlet for å muliggjøre histologiske programmer og berikelse av RNA for genekspresjon målinger ved hjelp av naboregionene fra et enkelt museskjelettmuskulatur. Høy kvalitet RNA er hentet fra 20 – 30 mg av sammenslåtte frysesnitt og målinger sammenlignet direkte på tvers av applikasjoner.

Abstract

Med denne metoden blir påfølgende frysesnitt samles for å muliggjøre både mikroskopi applikasjoner for vev histologi og anrikning av RNA for genuttrykk ved bruk av tilstøtende områder fra et enkelt museskjelettmuskulatur. Vanligvis er det vanskelig å oppnå tilstrekkelig homogenisering av små skjelettmuskelprøver fordi buffervolum kan være for lavt for effektiv sliping, men uten tilstrekkelig mekanisk avbrudd, den tette vev arkitektur muskel grenser penetrasjon av buffer reagenser, slutt forårsaker lav RNA yield. Ved å følge protokollen angitt her, er 30 um seksjoner oppsamlet og slått sammen slik at cryosectioning og påfølgende nål homogenisering for å mekanisk å forstyrre muskelen, å øke overflatearealet som utsettes for buffer penetrasjon. De primære begrensninger av teknikken er at det krever en cryostat, og det er forholdsvis liten produksjon. Imidlertid kan høy kvalitet RNA fås fra små prøver av oppsamlet muscle frysesnitt, noe som gjør denne fremgangsmåte er tilgjengelig i mange forskjellige skjelettmuskler og annet vev. Videre muliggjør denne teknikken matchet analyser (f.eks vev histopatologi og genekspresjon) fra tilstøtende regioner i en enkelt muskel-skjelettlidelser, slik at målinger kan sammenlignes direkte på tvers av programmer for å redusere eksperimentell usikkerhet og for å redusere replikative dyreforsøk er nødvendig for å kilden en liten vev for flere programmer.

Introduction

Målet med denne teknikken er å gjøre flere eksperimentelle analyser av ulike modaliteter, for eksempel histologi og genuttrykk, tilgjengelig fra en enkelt liten skjelettmuskulatur kilde vev. Mikros programmer som er mest følsomme for å smake konserveringsmetoder, som må kontrolleres nøye for å begrense dannelsen av iskrystall gjenstander under nedfrysing. Således er metodeutvikling basert på den muskel tibialis anterior (TA) frosne delvis dekket med innstøping harpiks i en -140 ° C med flytende nitrogen avkjølte 2-metylbutan bad som kildemateriale for både immunfluorescens-mikroskopi og genekspresjon analyser.

Behovet for å bruke samme kildemateriale for ulike tekniske tilnærminger er spesielt viktig for intramuskulær injeksjon baserte eksperimenter der venstre og høyre musklene representerer ulike forhold, en eksperimentell og en kontroll. For eksempel i muskel regenerering studier, en muscle injiseres med en gift for å forårsake omfattende vevsskade mens kontralaterale muskelen fungerer som et redskap-injisert kontroll ^en. Tilsvarende genterapistudier for muskelforstyrrelser begynner vanligvis med validering av genterapi vektoren ved intramuskulær injeksjon for å bli sammenlignet med tom vektor, som ikke er relatert vektor eller bærerkontroll på den kontralaterale side ^2. Derfor er det ikke mulig å kilden hver TA muskelen til et annet program.

Vanlige strategier for å håndtere dette problemet er: i) å bruke en annen muskelgruppe for hvert program, ii) å bruke flere mus, eller iii) å kutte av et stykke av muskelen for hvert program. Men store forskjeller mellom muskelgrupper gjør det vanskelig å sammenligne data fra forskjellige programmer, og flere dyr øke utgiftene og er dårlig begrunnet dersom andre alternativer eksisterer. Splitte muskler etter disseksjon til kilden forskjellige applikasjoner er det beste alternativet in mange tilfeller. Imidlertid muskel stykkene er ofte for liten til å bruke pulverisering under flytende nitrogen eller mekaniske slipeteknikker for homogenisering ^2-5. Som muskel er et meget strukturell vev pakket med ekstracellulære matrise og kontraktile proteiner, fører utilstrekkelig mekanisk homogenisering til et lavt utbytte av påfølgende DNA, RNA eller protein. Metoden beskrevet her gjør at små mengder vev fra en kilde muskel for bruk i flere programmer, og inkludering av cryosectioning og nål finmaling forbedrer mekanisk homogenisering for bedre RNA yield.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of Georgia Institutional Animal Care og bruk komité i henhold til bruk dyr protokollen A2013 07-016 (Beedle). 1. kryokonservering fiksert Skeletal Muscle Preparat Skjær kork i små firkanter (ca. 1 cm x 1 cm) med et barberblad, skrive på korken med en fin spiss markør som er resistent mot to-methylbutane å identifisere kilden mus og muskler, og gjør en veldig grunt kutt (ca. 1 mm) over den øvre overflate. Sett en plastglass i snittet som s…

Representative Results

Muscle cryosection RNA er høy kvalitet og gir tilstrekkelig avkastning for de fleste bruksområder Analyser av seksten skjelettmuskel RNA- preparater er vist i tabell 1 under anvendelse av 19,4 til 41 mg av samle tibialis anterior (TA) muskel fra 8 kontrollmus. Både venstre (L) og høyre (R) TA muskler ble utarbeidet i regenerering eksperimenter med muskler samlet 3 dager etter lengdeintramusku…

Discussion

To achieve best results with this method, keep embedding resin restricted to the lower third or half of the muscle during tissue cryopreservation because excess resin will slow the collection of the pooled cryosections and may increase embedding resin contamination in the RNA isolation. Also, careful attention during needle homogenization is important to maximize yield and minimize the probability of clogging the needle. The protocol may be modified by using a Luer-Lok syringe to protect against sample loss if the needle…

Materials

Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 mL syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process.  E.g. ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT