Cryosectioning angränsande regionerna i samma mus skelettmuskulatur för genuttryck och histologiska analyser

Summary

Konsekutiva Cryo-sektioner samlas in för att göra det möjligt för histologiska applikationer och anrikning av RNA för genuttryck mätningar med angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Hög kvalitet RNA erhålls från 20 – 30 mg poolade kryosnitt och mätningar direkt jämföras mellan program.

Abstract

Med den här metoden är konsekutiva kryosnitt samlas in för att göra det möjligt för både mikroskopi applikationer för vävnads histologi och anrikning av RNA för genuttryck med hjälp av angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Normalt är det en utmaning att uppnå adekvat homogenisering av små skelettmuskelprover eftersom buffertvolymer kan vara för låg för effektiva sliptillämpningar, men utan tillräcklig mekanisk störning, den täta vävnad arkitektur muskel gränser penetration av buffertreagens, slutligen orsakar låg RNA avkastning. Genom att följa det protokoll som rapporteras här, är 30 | j, m sektioner uppsamlades och slogs samman vilket gör cryosectioning och efterföljande nål homogenisering för att mekaniskt störa muskeln, vilket ökar den yta som utsätts för buffert penetration. De primära begränsningarna i tekniken är att den kräver en kryostat, och det är relativt låg genomströmning. Däremot kan hög kvalitet RNA erhållas från små prover av poolade muscle kryosnitt, vilket gör denna metod tillgänglig för många olika skelettmuskler och andra vävnader. Dessutom möjliggör denna teknik matchade analyser (t.ex. vävnad histopatologi och genuttryck) från intilliggande regioner i en enda skelettmuskel så att mätningar kan direkt jämföras mellan program för att minska experimentell osäkerhet och att minska replikations djurförsök nödvändigt att köpa en liten vävnad för flera applikationer.

Introduction

Målet med denna teknik är att göra flera experimentella analyser av olika metoder, såsom histologi och genuttryck, tillgänglig från en enda liten skelettmuskulatur källvävnaden. Mikroskopi applikationer är mest känsliga för prov konserveringsmetoder, som måste kontrolleras noggrant för att begränsa bildandet av iskristall artefakter under frysförvaring. Således är metodutveckling baserad på tibialis anterior (TA) muskel frysta delvis täckt med inbäddning harts i en -140 ° C flytande kväve kyld 2-metylbutan bad som källmaterial för både immunofluorescensmikroskopi och genuttryck analyser.

Behovet av att använda samma källmaterial för olika tekniska tillvägagångssätt är särskilt viktigt för injektionsbaserade intramuskulära experiment där vänster och höger muskler representerar olika villkor, en experimentell och en kontroll. Till exempel i muskelregenereringsstudier, en muscle injiceras med ett toxin för att orsaka omfattande vävnadsskada, medan det kontralaterala muskeln fungerar som en fordons injicerad kontroll ^1. På samma sätt, genterapistudier för muskelsjukdomar börjar vanligtvis med validering av genterapivektor genom intramuskulär injektion att jämföras med tom vektor, orelaterade vektor eller vehikelkontroll på den kontralaterala sidan ^2. Därför är det inte möjligt att köpa varje TA muskler till ett annat program.

Gemensamma strategier för att ta itu med denna fråga är: i) att använda en annan muskelgrupp för varje applikation, ii) att använda ytterligare möss, eller iii) att skära av en bit av muskeln för varje applikation. Men betydande skillnader mellan muskelgrupper gör det svårt att jämföra data från olika applikationer, och ytterligare djur ökar kostnader och är dåligt motiverade om andra alternativ finns. Dela muskeln efter dissektion att köpa olika applikationer är det bästa alternativet in många fall. Men muskel bitar är ofta för små för att använda pulvrisering under flytande kväve eller mekaniska sliptekniker för homogenisering ^2-5. Muskel är en mycket strukturell vävnad packad med extracellulära matrix och sammandragande proteiner leder otillräcklig mekanisk homogenisering till ett lågt utbyte av efterföljande DNA, RNA eller protein. Metoden beskrivs här gör att små mängder av vävnad från en källa muskel för användning i flera tillämpningar, och införandet av cryosectioning och nål triturering förbättrar mekanisk homogenisering för bättre RNA avkastning.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of Georgia Institutional Animal Care och användning kommittén enligt djuranvändning protokoll A2013 07-016 (Beedle). 1. Frysförvaring av Ofixerad skelettmuskulatur Förberedelse Skär kork i små fyrkanter (ca 1 cm x 1 cm) med ett rakblad, skriva på korken med en fin spets markör som är resistent mot 2-metylbutan att identifiera källan musen och muskler, och gör en mycket grunt snitt (ungefär 1 mm) över den övre ytan. Sätt en plasttäck …

Representative Results

Muscle kryosektion RNA är hög kvalitet och ger tillräcklig avkastning för de flesta applikationer Analyser av sexton skelettmuskel RNA-beredningar visas i tabell 1 med användning av 19,4 till 41 mg av poolade tibialis anterior (TA) muskler från 8 kontrollmöss. Både vänster (L) och höger (R) TA muskler framställdes i regenereringsförsök med muskler som samlats 3 dagar efter längd int…

Discussion

För att uppnå bästa resultat med denna metod, hålla bädda harts begränsas till den nedre tredjedel eller hälften av muskeln under vävnadsfrysförvaring, eftersom överskott av harts kommer att bromsa insamlingen av poolade kryosnitt och kan öka bädda föroreningar harts i RNA-isolering. Dessutom är noggrann uppmärksamhet under nålen homogenisering viktigt att maximera avkastningen och minska risken för igensättning av nålen. Protokollet kan modifieras genom användning av en Luer-Lok spruta för att skyd…

Materials

Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 mL syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process.  E.g. ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT