מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך
Summary
אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.
Abstract
כיום ישן עניין רב ביצירת מערכי הורה איי חלבון דבק בים של משטח פסיבציה ללימודי תא ביולוגיים. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי תאי חיים מגיבים, לא רק לאופי ביוכימיים של המולקולות שהוצגו בפניהם, אלא גם דרך מולקולות אלה מוצגות. יצירת מיקרו-דפוסי חלבון ולכן עכשיו תקן במעבדות הביולוגיה רבים; דפוסים-ננו הם גם יותר נגישים. עם זאת, בהקשר של אינטראקציות תא-תא, יש צורך הדפוס לא רק חלבונים אלא גם bilayers שומנים. דפוסים proteo-lipidic כפול כזה עד כה לא היה נגיש. אנו מציעים טכניקה קלילה ליצור נקודות ה- Nano חלבון נתמכות על זכוכית ולהציע שיטה לבצע מילוי חוזר של החלל הבין-הנקודה עם bilayer שומנים נתמך (SLB). מ-הלבנת תמונה של נותב ניאון שומנים כלולים SLB, אנו מדגימים כי bilayer מציג ניכר-PLנזילות Ane. Functionalizing נקודות החלבון עם קבוצות פלורסנט מאפשרת לנו לדמות אותם וכדי להראות שהם מסודרים סריג משושה רגיל. גודל הנקודה הטיפוסי הוא כ 800 ננומטר לבין המרווח הפגין כאן הוא 2 מיקרון. מצעים אלו צפויים לשמש פלטפורמות שימושיות כמו הידבקות תא, גירה ולימודים-חישת mechano.
Introduction
הידבקות התא מתבצעת באמצעות מולקולות הדבקה תא מתמחה (מצלמות), חלבונים המצויים על גבי קרום התא המסוגלים מחייב עמיתו שלהם על מטריצה חוץ-תאית או על תא אחר. על תאים דבקים, המולקולות הדבקות ביותר כולל integrin ו cadherin בכל המקום, נמצאות בצורת אשכולות 1. האינטראקציה של לימפוציטים מסוג T (תאי T) עם תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים) מספקת המחשה בולטת עוד יותר לחשיבות של אשכולות קולטן נוצרו על הממשק בין שני התאים – לעתים קרובות נקרא סינפסה אימונולוגית. לאחר יצירת הקשר הראשוני עם קולטנים בתא APC, T (TCRs) על פני השטח של האשכולות בקנה מידת T תא טופס מיקרון המשמשים איתות פלטפורמות 2, 3, 4, והם בסופו של דבר מרוכז כדי ליצור אשכול מולקולרי מרכזי גדול (cSMAC )נַעֲרָה = "Xref"> 5, 6, 7. לאחרונה, ניתן היה לראות כי בצד APC, הליגנדים של TCR גם מקובצים 8.
בהקשר של אינטראקצית T תא-APC, פריסת מערכות היברידיות, שבו APC היא חיקתה ידי משטח מלאכותי פונקציונלי עם חלבונים רלוונטיים, יש מאוד קדם את ההבנה שלנו של הממשק הסינפטי 2, 3, 4, 5, 6, 7 . בהקשר זה, היא רלוונטית מאוד לעצב משטחים כוזבים APC כי ללכוד אחד או יותר בהיבטים של תא המטרה. לדוגמה, אם הליגנדים הם מורכבים על bilayers השומנים נתמך, הם יכולים לפזר את המטוס של bilayer, לחקות את המצב על פני השטח APC ובאותו זמן לאפשר היווצרות של6 cSMAC, 7. בדומה לכך, באשכולות על APC כבר חיקו ידי יצירת אי של הליגנדים בים של פולימרים 9, 10, 11, 12, 13, 14. עם זאת, יש שתי תכונות אלה עד כה לא שולבו.
כאן אנו מתארים שיטה חדשנית ליצירת נקודות ה- Nano של אנטי CD3 (נוגדן שפוגע במתחם TCR) מוקף bilayer השומנים עם שומנים לשדר. את bilayer מופקד באמצעות לנגמיואיר-Blodgett / לנגמיואיר-שייפר טכניקה 7, 15, 16 ו אם רוצים, אפשר פונקציונליות עם חלבון מסוים – למשל, ליגנד של integrin תא T (שנקרא ICAM1). בנוסף, cou נקודות חלבון אנטי CD3ld להיות מוחלף באחר נוגדן או CAM. בעוד בחרנו את החלבונים לשימוש עתידי כפלטפורמה למחקרים דבקים של תאי T, את האסטרטגיה המפורטת כאן ניתן להתאים לכל חלבון ואפילו DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול שתואר לעיל קשורים להיווצרות של נקודות ה- Nano חלבון או האחורי-ומילוי השטח סביב הנקודות ידי bilayer שומנים נתמך. השלב הקריטי הראשון ביחס ונקודות ננו חלבון הוא הכנת החרוז-המסכה. הניקוי של הכיסוי שקופית הוא קריטי. השקופיות צורכות לנקות או בתמיס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לורן Limozin, פייר דילארד אסטריד וואהל להמשך דיונים פוריים על יישומי הסלולר. אנו מודים גם פרדריק Bedu ממתקן cleanroom PLANETE על עזרתו עם תצפיות SEM. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המועצה האירופית למחקר באמצעות מס מענק 307,104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
