אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.
כיום ישן עניין רב ביצירת מערכי הורה איי חלבון דבק בים של משטח פסיבציה ללימודי תא ביולוגיים. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי תאי חיים מגיבים, לא רק לאופי ביוכימיים של המולקולות שהוצגו בפניהם, אלא גם דרך מולקולות אלה מוצגות. יצירת מיקרו-דפוסי חלבון ולכן עכשיו תקן במעבדות הביולוגיה רבים; דפוסים-ננו הם גם יותר נגישים. עם זאת, בהקשר של אינטראקציות תא-תא, יש צורך הדפוס לא רק חלבונים אלא גם bilayers שומנים. דפוסים proteo-lipidic כפול כזה עד כה לא היה נגיש. אנו מציעים טכניקה קלילה ליצור נקודות ה- Nano חלבון נתמכות על זכוכית ולהציע שיטה לבצע מילוי חוזר של החלל הבין-הנקודה עם bilayer שומנים נתמך (SLB). מ-הלבנת תמונה של נותב ניאון שומנים כלולים SLB, אנו מדגימים כי bilayer מציג ניכר-PLנזילות Ane. Functionalizing נקודות החלבון עם קבוצות פלורסנט מאפשרת לנו לדמות אותם וכדי להראות שהם מסודרים סריג משושה רגיל. גודל הנקודה הטיפוסי הוא כ 800 ננומטר לבין המרווח הפגין כאן הוא 2 מיקרון. מצעים אלו צפויים לשמש פלטפורמות שימושיות כמו הידבקות תא, גירה ולימודים-חישת mechano.
הידבקות התא מתבצעת באמצעות מולקולות הדבקה תא מתמחה (מצלמות), חלבונים המצויים על גבי קרום התא המסוגלים מחייב עמיתו שלהם על מטריצה חוץ-תאית או על תא אחר. על תאים דבקים, המולקולות הדבקות ביותר כולל integrin ו cadherin בכל המקום, נמצאות בצורת אשכולות 1. האינטראקציה של לימפוציטים מסוג T (תאי T) עם תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים) מספקת המחשה בולטת עוד יותר לחשיבות של אשכולות קולטן נוצרו על הממשק בין שני התאים – לעתים קרובות נקרא סינפסה אימונולוגית. לאחר יצירת הקשר הראשוני עם קולטנים בתא APC, T (TCRs) על פני השטח של האשכולות בקנה מידת T תא טופס מיקרון המשמשים איתות פלטפורמות 2, 3, 4, והם בסופו של דבר מרוכז כדי ליצור אשכול מולקולרי מרכזי גדול (cSMAC )נַעֲרָה = "Xref"> 5, 6, 7. לאחרונה, ניתן היה לראות כי בצד APC, הליגנדים של TCR גם מקובצים 8.
בהקשר של אינטראקצית T תא-APC, פריסת מערכות היברידיות, שבו APC היא חיקתה ידי משטח מלאכותי פונקציונלי עם חלבונים רלוונטיים, יש מאוד קדם את ההבנה שלנו של הממשק הסינפטי 2, 3, 4, 5, 6, 7 . בהקשר זה, היא רלוונטית מאוד לעצב משטחים כוזבים APC כי ללכוד אחד או יותר בהיבטים של תא המטרה. לדוגמה, אם הליגנדים הם מורכבים על bilayers השומנים נתמך, הם יכולים לפזר את המטוס של bilayer, לחקות את המצב על פני השטח APC ובאותו זמן לאפשר היווצרות של6 cSMAC, 7. בדומה לכך, באשכולות על APC כבר חיקו ידי יצירת אי של הליגנדים בים של פולימרים 9, 10, 11, 12, 13, 14. עם זאת, יש שתי תכונות אלה עד כה לא שולבו.
כאן אנו מתארים שיטה חדשנית ליצירת נקודות ה- Nano של אנטי CD3 (נוגדן שפוגע במתחם TCR) מוקף bilayer השומנים עם שומנים לשדר. את bilayer מופקד באמצעות לנגמיואיר-Blodgett / לנגמיואיר-שייפר טכניקה 7, 15, 16 ו אם רוצים, אפשר פונקציונליות עם חלבון מסוים – למשל, ליגנד של integrin תא T (שנקרא ICAM1). בנוסף, cou נקודות חלבון אנטי CD3ld להיות מוחלף באחר נוגדן או CAM. בעוד בחרנו את החלבונים לשימוש עתידי כפלטפורמה למחקרים דבקים של תאי T, את האסטרטגיה המפורטת כאן ניתן להתאים לכל חלבון ואפילו DNA.
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול שתואר לעיל קשורים להיווצרות של נקודות ה- Nano חלבון או האחורי-ומילוי השטח סביב הנקודות ידי bilayer שומנים נתמך. השלב הקריטי הראשון ביחס ונקודות ננו חלבון הוא הכנת החרוז-המסכה. הניקוי של הכיסוי שקופית הוא קריטי. השקופיות צורכות לנקות או בתמיס…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לורן Limozin, פייר דילארד אסטריד וואהל להמשך דיונים פוריים על יישומי הסלולר. אנו מודים גם פרדריק Bedu ממתקן cleanroom PLANETE על עזרתו עם תצפיות SEM. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המועצה האירופית למחקר באמצעות מס מענק 307,104 FP / 2007-2013 / ERC.
Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
Observation chamber | Home made | |
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
Desiccator | Labbox | |
Crystallizer | Shott | |
Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
Water MQ | ELGA, Veolia France | |
Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
Film balance | NIMA | Medium |
Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |