Electrophorèse Capillaire séparation de l'anticorps monoclonal isoformes Utilisation d'un Capillaire Neutre
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des protéines biothérapeutiques avec un intérêt croissant en raison de leur capacité d'agir contre plusieurs maladies chroniques et dégénératives 1. Comme d' autres biomolécules, les mAb sont sujettes à subir plusieurs modifications physico – chimiques à tous les stades de leur cycle de vie (ie, de la biosynthèse du produit final). De telles modifications comprennent, mais sans s'y limiter: la désamidation, la glycosylation, l' oxydation, la cyclisation, l' isomérisation, l' agrégation et le clivage protéolytique 2. Par conséquent, les techniques d'analyse capables de résoudre les isoformes intrinsèques sont nécessaires pour surveiller les mAb hétérogénéité et de la stabilité dans le but d'établir des spécifications de qualité.
L'électrophorèse capillaire (CE) est une technologie de séparation haute performance réalisée outinside d'un tube de silice fondue étroite (plage um) remplie d'un électrolyte de fond (BGE). Lors de l'application d'un champ électrique (jusqu'à 30 000 V), molécule chargées migrent vers l'électrode avec une charge opposée ( à savoir, la séparation entraîné électro-). L'utilisation de tensions élevées en CE permet des analyses rapides et une plus grande efficacité, qui sont supérieures à une électrophorèse sur gel classique. Électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique basée CE couramment utilisé dans l'industrie biopharmaceutique pour l' évaluation de la qualité du produit 3-9. Contrairement à d' autres modes de CE (par exemple, l' électrophorèse sur gel capillaire, capillaire isoélectrofocalisation) ou des méthodes basées sur la chromatographie, CZE peut être effectuée sans utiliser dénaturants ou interfaces en phase solide, ce qui permet l'analyse de l'hétérogénéité inhérente des mAb proches de leur état natif 10 . Séparation CZE des isoformes mAb se produit à l' intérieur d'un capillaire en silice fondue recouverte d'un polymère hydrophile (capillaire neutre) et est basé sur leur mobilité électrophorétique différente, qui est gouverné par la charge, la masse, la taille et la forme (ou volume hydrodynamique) 11. fractions mAb sont détectées lorsqueils sont mobilisés et passent à travers la fenêtre de détection, qui est détecté par un détecteur ultraviolet (UV) de l' absorbance à 214 nm 4.
La mise en œuvre réussie de cette technique d'analyse dépendra de l'attention voulue aux détails avant et pendant l'expérience. Agir autrement augmentera le coût et le temps de procéder à l'analyse, conduisant finalement à l'échec et la frustration constante.
Ici, nous présentons un guide étape par étape pour effectuer une analyse réussie de mAb hétérogénéité par CZE par l'explication détaillée de la préparation des solutions et des échantillons, la préparation du système de CE, les méthodes d'instruments mis en place, l'acquisition de données, et le traitement. Aux fins de ce tutoriel, un anti-facteur de nécrose tumorale alpha entièrement humain recombinant (anti-TNF) mAb est utilisé comme modèle de protéine; Cependant, ce protocole peut être facilement personnalisé pour l'analyse d'autres protéines qui envisagent de brèves modifications. UNEn outre, plusieurs recommandations visant à atténuer les problèmes potentiels sont proposés. Le lecteur est invité à suivre strictement le protocole proposé, comme la probabilité de réussir augmentera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce tutoriel, nous mettons en évidence l'importance des pratiques appropriées lors de la conduite CZE analyse de mAb afin d'augmenter la probabilité de réussir. Toutefois, lorsque CZE est utilisé sur une base régulière, les questions se posent inévitablement 12.
Pour de meilleurs résultats, il est important de suivre les notes qui ont été inclus dans l'ensemble du protocole, car elles aideront l'analyste à surmonter et résoudre les étapes difficil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
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