הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים (מבז) הם חלבונים biotherapeutic עם הגדלת הריבית בשל יכולתם לפעול נגד מספר 1 כרונית ניוונית מחלות. כמו ביומולקולות אחרות, מהבז נוטה לעבור שינויי physicochemical כמה בכל שלבי מחזור החיים שלהם (כלומר, מן ביוסינתזה למוצר הסופי). כזה שינויים כוללים, אך אינם מוגבלים ל: deamidation, glycosylation, חמצון, cyclization, isomerization, צבירה פרוטאוליטים מחשוף 2. לפיכך, שיטות אנליטיות מסוגלת לפתור isoforms המהותי יש צורך לפקח ההטרוגניות מבז ויציבות כדי להקים מפרט איכות.
אלקטרופורזה נימים (CE) היא טכנולוגית הפרדה גבוהה ביצועים נשאה outinside של צינור התמזג-סיליקה צר (טווח מיקרומטר) מלא עם אלקטרוליט רקע (BGE). במועד היישום של שדה חשמלי (עד 30,000 V), טעונה מולקולההים נודד לעבר אלקטרודה עם מטען נגדי (כלומר, פרדה מונחה אלקטרו). השימוש במתח גבוה ב CE מאפשר ניתוחים מהירים התייעלות, אשר עדיפים על ג'ל אלקטרופורזה קלסית. אלקטרופורזה אזור נימים (CZE) היא טכניקה מבוססת לספירה בשימוש השיגרתי בתעשיית הביו-פרמצבטיקה להערכת איכות מוצר 3-9. בניגוד מצבים אחרים של לסה"נ (למשל, ג'ל אלקטרופורזה נימי, איזואלקטרית נימי התמקדות) או בשיטות מבוססות כרומטוגרפיה, CZE יכול להתנהל ללא שימוש denaturants או ממשקי-שלב מוצק, המאפשר ניתוח של בהטרוגניות הטבועה מבז קרוב למצב הטבעי שלהם 10 . הפרדת CZE של isoforms מב מתרחשת בתוך נימים התמזג-סיליקה מכוסות פולימר הידרופילי (נימים ניטראליות), והיא מבוססת על ניידות electrophoretic השונה שלהם, אשר נשלטת על ידי תשלום, המוני, גודל וצורה (או נפח הידרודינמית) 11. moieties מב מזוהה כאשרהם מגויסים ועוברים דרך חלון איתור, אשר חשו על ידי גלאי אולטרה סגול (UV) ספיגת ב 214 ננומטר 4.
היישום המוצלח של שיטה אנליטית זה יהיה תלוי תשומת לב ראויה פרטים לפני ובמהלך הניסוי. ממלא מקום אחר יגדיל את העלות והזמן לבצע את הניתוח, ובסופו של דבר מוביל כישלון ותסכול מתמידים.
כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד מדריך כדי לבצע ניתוח מוצלח של ההטרוגניות מב ידי CZE דרך ההסבר המפורט של הכנת פתרונות ודוגמאות, הכנת מערכת לספירה, שיטות המכשירות להגדיר, רכישת הנתונים, עיבוד נתונים. לצורך הדרכה זו, אלפא גורם נמק אנטי סרטניים רקומביננטי אנושי מלא (אנטי-TNFα) מב משמש כמודל חלבון; עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם אישית בקלות על הניתוח של חלבונים אחרים בהתחשב שינויים קצרים. אdditionally, כמה המלצות כדי להקטין בעיות פוטנציאליות מוצעות. הקורא מוזמן לעקוב אחר הפרוטוקול המוצע בקפדנות, בהסתברות להצליח יגדל.
Protocol
Representative Results
Discussion
במדריך זה, אנו מדגישים את החשיבות של שיטות נכונות בעת ביצוע CZE מנתח של מבז כדי להגדיל את ההסתברות להצליח. עם זאת, כאשר CZE משמש על בסיס שגרתי, מתעוררות בעיות בלתי נמנע 12.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לעקוב אחר ההערות שנכללו ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis. Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).
- Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).
- He, Y., et al. Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column. Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).
- He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).
- Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods. J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins. Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).
- Altria, K. D., Altria, K. D. Troubleshooting. Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).
- Ma, S., Nashabeh, W. Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis. Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).
- Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital. Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).
