Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
Monoklonale Antikörper (mAb) sind Biotherapeutikum Proteine mit steigendem Interesse aufgrund ihrer Handlungsfähigkeit gegen mehrere chronische und degenerative Krankheiten 1. Wie andere Biomoleküle sind mAbs anfällig mehrere physikalisch – chemische Modifikationen in allen Phasen ihres Lebenszyklus zu unterziehen (dh von Biosynthese zum Endprodukt). Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf : Desamidierung, Glykosylierung, Oxidation, Cyclisierung, Isomerisierung, Aggregation und proteolytische Spaltung 2. Daher analytische Techniken der Lage intrinsische Isoformen zu lösen sind erforderlich mAbs Heterogenität und Stabilität, um zu überwachen, um Qualitätsanforderungen herzustellen.
Kapillarelektrophorese (CE) ist ein Hochleistungstrenntechnik outinside eines schmalen Quarzglasröhre (& mgr; m-Bereich) gefüllt durch mit einem Hintergrundelektrolyten (BGE). Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (bis zu 30.000 V), geladenes Moleküls wandern in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung (dh elektrogetriebene Trennung). Die Verwendung von hohen Spannungen in CE ermöglicht schnelle Analysen und erhöhte Effizienz, die der Elektrophorese klassischen Gel überlegen sind. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine CE-basierte Technik routinemäßig in der biopharmazeutischen Industrie für die Produktqualität Beurteilung verwendet 3-9. Im Gegensatz zu anderen Formen der CE (zB Kapillar – Gel – Elektrophorese, Kapillar – isoelektrische Fokussierung) oder Chromatographie-basierte Methoden können CZE ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Festphasen – Schnittstellen durchgeführt werden, so dass die Analyse der inhärenten Heterogenität der mAbs nahe an ihrem nativen Zustand 10 . CZE Trennung von mAb – Isoformen auftritt innerhalb einer Fused-Silica – Kapillare mit einem hydrophilen Polymer (neutral Kapillare) abgedeckt und auf der Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität, die durch Ladung, Masse, Größe und Form (oder hydrodynamischen Volumen) 11 ausgeschlossen ist. mAb-Einheiten detektiert, wennsie mobilisiert und durch das Erfassungsfenster, das 4 durch ein Ultraviolett (UV) Absorptionsdetektor bei 214 nm gemessen wird.
Die erfolgreiche Umsetzung dieser Analysetechnik wird vor und während des Experiments zu Details über angemessene Aufmerksamkeit abhängen. Acting sonst wird die Kosten und die Zeit erhöhen, um die Analyse durchzuführen, was letztlich zu konstanten Versagen und Frustration führen.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, eine erfolgreiche Analyse von mAb Heterogenität durch CZE durch die detaillierte Erläuterung der Herstellung von Lösungen und Proben durchzuführen, die Herstellung von CE-System, das Instrument Verfahren einzurichten, die Datenerfassung und das Verarbeiten. Für die Zwecke dieses Tutorial, eine rekombinante vollständig humanen Anti-Tumor-Nekrose-Faktor alpha (anti-TNF) mAb als Proteinmodell verwendet wird; jedoch kann dieses Protokoll leicht für die Analyse von anderen Proteinen unter Berücksichtigung kurze Änderungen angepasst werden. EINußerdem, mehrere Empfehlungen zu mildern sind mögliche Probleme vorgeschlagen. Der Leser wird aufgefordert, zu streng, die vorgeschlagene Protokoll folgen, da die Wahrscheinlichkeit erhöhen, um erfolgreich zu sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Tutorial zeigen wir die Bedeutung der richtigen Praktiken bei der Durchführung von CZE von mAb analysiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, um erfolgreich zu sein. Wenn jedoch CZE auf einer Routinebasis verwendet wird, Probleme entstehen zwangsläufig 12.
Für die besten Ergebnisse ist es wichtig, die Hinweise zu folgen, die das ganze Protokoll aufgenommen wurden, da sie den Analytiker schwierige Schritte zu überwinden und zu beheben helfen. Eine wichtige Überle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
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